Seguimiento de la dinámica de la infección bacteriana en un ratón mediante bioluminiscencia

Resumen

Fuente: Valentine, M. E., et al. Generación de mutantes de deleción génica en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas de atenuación de virulencia en un modelo simple de infección en ratón. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra el uso de la bioluminiscencia para visualizar y comparar el comportamiento in vivo de cepas bacterianas virulentas y atenuadas en ratones. Describe la preparación de suspensiones bacterianas bioluminiscentes y su inyección intraperitoneal en ratones. La cepa virulenta exhibe diseminación sistémica, mientras que la cepa atenuada permanece localizada y se elimina gradualmente, como lo indica la señal de desvanecimiento.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Inoculación de animales con cepas bacterianas por inyección
   1. En la mañana de las inyecciones, retire los crioviales de las cepas bacterianas que se están probando y descongele a 4 ° C durante 3-4 h. Descongele 0,5 ml por cada ratón que se inyectará. Mantenga los viales en hielo después de descongelarlos e inyecte a los ratones dentro de las 2 h.
   2. Después de descongelar, transfiera cada criovial a un nuevo tubo de 2 ml y centrifugue a 4.500 x g durante 10 min, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato).
   3. Centrifugar de nuevo a 4.500 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 1x PBS a una concentración final de 2,5 x 10⁹ UFC/ml (UFC: unidades formadoras de colonias). La cantidad exacta de 1x PBS utilizada variará ligeramente entre cepas.
      1. Tome 3 muestras de la suspensión final de cada cepa para validar UFC/ml, genotipo y fenotipo como se describe anteriormente.
   4. Para cada cepa, alícuota 1,5 ml de PBS/suspensión celular en un tubo de 2 ml por cada 5 ratones para limitar el número de veces que se introduce el tubo. Además, prepare tubos de 1x PBS para inyecciones de control.
   5. Reúna ratones (10 machos y 10 hembras C57BL / 6 por grupo para este experimento) y los materiales necesarios para las inyecciones (jeringas, agujas, recipientes para objetos punzantes, marcadores, lápiz y papel, etc.). Traslado a la sala quirúrgica de animales estériles. Limpie todas las superficies con toallitas desinfectantes.
      1. Para eliminar la angustia y el riesgo de lesiones para el experimentador, solo lleve un sexo y un grupo experimental de ratones a la sala quirúrgica a la vez (por ejemplo, un grupo de 10 ratones machos para infectarse con una cepa en particular). Use dos pares de guantes de látex para eliminar la perforación de los guantes si son mordidos. Use bata de laboratorio, gafas de seguridad y mascarilla para evitar la contaminación.
   6. Comience las inyecciones del grupo de control con 1x PBS. Esto determinará si la inyección sola produce efectos adversos.
      1. Saca un ratón de la jaula. Solo retire un mouse a la vez.
      2. Pese el ratón y marque su cola con un marcador permanente para rastrear la pérdida de peso después de la inyección.
      3. Abra una nueva jeringa de 1 ml y una aguja de 27 G (use una jeringa y una aguja nuevas para cada ratón para eliminar la contaminación) e inyecte 200 μl de PBS estéril 1x.
         1. Agarra el ratón detrás de las orejas con el pulgar y el índice. Pellizque para crear un pliegue de piel en la nuca para sujetarse: un pliegue más apretado reduce el movimiento del cuello y el riesgo de ser mordido durante la inyección. Asegure la cola en la palma usando el meñique para mantener al ratón plano con poco movimiento.
         2. Dé la vuelta al mouse e inserte la aguja en un ángulo de 30 ° en la cavidad peritoneal hacia el lado izquierdo o derecho de la línea media. Levante ligeramente la aguja una vez insertada para asegurarse de que se insertó en el área intraperitoneal y no en los órganos. Inyecte lentamente el PBS y luego retire la aguja.
         3. Coloque la aguja usada en un recipiente designado para objetos punzantes de riesgo biológico. No reutilice la jeringa o la aguja. Un bolo en el lugar de la inyección es típico.
      4. Después de la inyección, mueva el ratón a una jaula separada.
      5. Repita el procedimiento con el siguiente mouse. Después de inyectar todos los ratones de una jaula, devuélvalos a su jaula original inmediatamente.
   7. Después de inyectar el grupo de control, comience a inyectar suspensiones de cepas que se probarán siguiendo el mismo procedimiento.
      1. Inyecte 200 μL de la suspensión celular. Al comenzar con suspensiones celulares de 2,5 x 10⁹ UFC/ml, cada ratón recibe 5 x 10⁸ UFC.
         NOTA: Estas concentraciones se optimizaron con investigaciones preliminares en animales para determinar las dosis letales de cada cepa. Es posible que sea necesario ajustar la dosis para otras cepas / especies.
   8. Una vez que se completen todas las inyecciones, devuelva a los ratones a la sala de alojamiento para aliviar la angustia. Limpie el área de trabajo con toallitas desinfectantes.
   9. Controle la mortalidad de los animales después de la inyección revisando las jaulas en busca de ratones muertos cada 3 h durante 72 h y cada 12 h durante 10 días. Registre el peso de los ratones cada 12 h para determinar la pérdida de peso debido a una enfermedad.

Materiales