Generación de recombinantes de doble cruce de Pseudomonas aeruginosa para la deleción de genes dirigidos

Resumen

Fuente: Valentine, M. E., et al. Generación de mutantes de deleción génica en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas de atenuación de virulencia en un modelo simple de infección en ratón. J. Vis. Exp. (2020).

Este video demuestra la generación de recombinantes de doble cruce en Pseudomonas aeruginosa utilizando una estrategia de deleción de genes basada en plásmidos. El proceso implica seleccionar bacterias que albergan un plásmido no replicativo integrado en el genoma a través de un solo cruce y luego inducir un segundo evento de recombinación bajo selección de sacarosa para extirpar el plásmido. La recombinación exitosa de doble cruce se confirma por la pérdida de resistencia a los antibióticos y la capacidad de crecer en medios que contienen sacarosa.

Protocolo

1. Detección de recombinantes de doble cruce de P. aeruginosa

1. Para cada cultivo en caldo, inocular 10 μL de cultivo en una placa precalentada de PIA (agar de aislamiento de Pseudomonas ) suplementada con sacarosa al 10% (sin glicerol) y raya para colonias aisladas. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
2. Al día siguiente, retire las placas de la incubadora e inspecciónelas para ver si crecen. Las colonias resistentes a la sacarosa deben ser recombinantes de doble cruce (es decir, haber eliminado el plásmido del cromosoma a través de un evento de recombinación entre la otra región homóloga del inserto del plásmido y el cromosoma P. aeruginosa ).
   1. Parchee al menos 20 colonias con palillos de dientes estériles en placas precalentadas de: 1) PIA, 2) PIA suplementada con sacarosa al 10% (sin glicerol) y 3) PIA suplementada con 300 μg / mL de carbenicilina.
3. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
4. Retire las placas de la incubadora y examínelas para ver si crecen. Los verdaderos recombinantes de doble cruce serán sensibles a la carbenicilina y resistentes a la sacarosa (es decir, colonias que crecieron con PIA y PIA suplementada con sacarosa, pero no crecieron con PIA suplementada con carbenicilina).

Materiales