Preparación y aislamiento de esporas de Streptomyces venezuelae a partir de un cultivo líquido

Resumen

Fuente: Schlimpert, S., et al. Imágenes de lapso de tiempo de fluorescencia del ciclo de vida completo de S. venezuelae utilizando un dispositivo microfluídico. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra el cultivo y aislamiento de esporas de Streptomyces venezuelae. Las esporas, células latentes que ayudan a las bacterias a sobrevivir al estrés, se producen durante la limitación de nutrientes y se recolectan mediante centrifugación. El método garantiza una suspensión de esporas pura y almacenada en frío para aplicaciones posteriores.

Protocolo

1. Aislamiento de esporas frescas de Streptomyces venezuelae y preparación del medio de cultivo gastado

1. Inocular 30 ml de medio de Extracto de Maltosa-Levadura-Extracto de Malta (MYM), suplementado con 60 μl de solución de oligoelementos R2 (TE), con 10 μl de esporas de la cepa SV60 [attBφBT1::p SS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]. Para un crecimiento y esporulación constantes de las células, use un matraz deflector o un matraz que contenga un resorte para permitir una aireación suficiente.
2. Cultive las células durante 35-40 h a 30 °C y 250 rpm.
3. Examine las células mediante microscopía de contraste de fase montada en líquido. En este punto, los fragmentos de micelio y las esporas serán visibles.
4. Centrifugar 1 ml de células en una centrífuga de mesa a 400 x g durante 1 min para granular el micelio y los fragmentos de células más grandes.
5. Transfiera aproximadamente 300 μl de sobrenadante que contiene una suspensión de esporas a un nuevo tubo de 1,5 ml y manténgalo en hielo. Conservar el medio de cultivo restante
6. Diluir las esporas 1:20 en MYM-TE (concentración final: 0,5-5 x 10⁷ esporas/ml) y mantener en hielo hasta que se necesite.
   NOTA: Aunque no se comprenden las condiciones exactas que desencadenan la esporulación en Streptomyces , el uso de medio MYM-TE gastado, incluidas las señales extracelulares desconocidas de un cultivo esporulante, estimula la esporulación.
7. Filtrar y esterilizar 10 ml del medio de cultivo restante para obtener MYM-TE gastado libre de esporas y fragmentos de micelio. Utilice un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm y transfiera MYM-TE gastado a un tubo estéril de 15 ml.
8. Mantener el MYM-TE gastado preparado durante unos días a 4 °C si se van a realizar experimentos adicionales con condiciones de crecimiento similares.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Extracto de maltosa y levadura (MYM)4 g de maltosa4 g de extracto de levadura10 g de extracto de maltaañadir 1 L H2O con un 50 % de agua del grifo y un 50 % de agua de ósmosis inversa y complementar con 200 ml de solución de oligoelementos R2 por 100 ml después del autoclave			Medio de esporulación utilizado para cultivar Streptomyces venezuelae SV60
R2 Solución de oligoelementos (TE)8 mg ZnCl240 mg FeCl3-6H 2O2 mg CuCl2-2H 2O2 mg MnCl2-4H 2O2 mg Na2B4O7-10H 2O2 mg (NH4)6Mo7O24-4H 2Oadd 200 ml H2OAutoclave y almacenar a 4 °C			Añadir 0,002 volúmenes a MYM
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Sigma	P4417-100TAB	Se utiliza para rellenar pozos de entrada de carriles no utilizados en placas B04A con el fin de preparar la placa para el almacenamiento a corto plazo.
Filtros de jeringa de 0,22 μm	Satorius stedim	16532-K	Preparación de MYM-TE gastado