Imágenes de lapso de tiempo de fluorescencia del ciclo de vida de Streptomyces venezuelae

Resumen

Fuente: Schlimpert, S. et al. Imágenes de lapso de tiempo de fluorescencia del ciclo de vida completo de S. venezuelae utilizando un dispositivo microfluídico. J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra imágenes de lapso de tiempo de fluorescencia del ciclo de vida completo de la bacteria Streptomyces venezuelae utilizando un dispositivo microfluídico para visualizar la germinación, el crecimiento de hifas y la esporulación en tiempo real.

Protocolo

1. Configuración del microscopio y el protocolo de lapso de tiempo

Nota: Este método se implementó en un microscopio de campo amplio invertido totalmente motorizado y automatizado equipado con una cámara sCMOS, una lámpara de halogenuros metálicos, un enfoque automático de hardware, un soporte de platina para placas de 96 pocillos y una cámara ambiental.

1. Precaliente la cámara ambiental a 30 °C con anticipación para evitar problemas con el enfoque automático después de comenzar el experimento. El tiempo requerido depende de la cámara ambiental utilizada, el microscopio y el sistema de calefacción. Comience a calentar el sistema la noche anterior al experimento.
2. Encienda el microscopio y el software de automatización y control de microscopía. Utilice un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica (NA) para una recopilación de señales y una resolución espacial óptimas, como un objetivo DIC de aceite de 100X y 1,46 NA. Seleccione filtros y espejos dicromáticos apropiados para adquirir imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) e imágenes de fusiones de proteínas fluorescentes amarillas y fluorescentes rojas.
3. Coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo y agregue líquido de inmersión en la parte inferior de la ventana de imágenes en la placa microfluídica para mejorar el enfoque celular durante la adquisición de imágenes. Monte con cuidado el dispositivo microfluídico sellado en la platina del microscopio invertido. Asegúrese de que la placa esté bien colocada en el soporte de la platina y no se mueva durante el transcurso del experimento.
4. Enfoque la ventana de imágenes de la cámara de cultivo microfluídico utilizando los marcadores de posición integrados para orientarse. Concéntrese en la parte más a la izquierda de la primera cámara de flujo (etiquetada como "A") con el tamaño de la trampa 5, correspondiente a una altura de trampa de 0,7 μm.
5. En el software de microfluídica, las células de carga del pozo de entrada 8 a 4 psi durante 15 segundos. Verifique la densidad celular en la cámara de cultivo moviendo la platina a través de la ventana de imágenes. Si no se atraparon esporas, repita el paso de carga celular o, alternativamente, aumente la presión de carga y/o el tiempo hasta que se logre la densidad celular deseada (1-10 esporas por ventana de imagen con 2,048 x 2,048 píxeles). Evite sobrecargar la cámara de cultivo. Nota: Normalmente usamos trampas de tamaño 5 para obtener imágenes de Streptomyces, pero también hemos obtenido buenos resultados con trampas de tamaños 4 y 3.
6. Inicie el programa de flujo en el software de control y deje que la placa microfluídica se equilibre térmicamente durante 1 hora en la platina del microscopio antes de comenzar la adquisición de imágenes.
7. En el software de control del microscopio, configure una adquisición multidimensional para tomar múltiples imágenes en múltiples posiciones de la etapa a lo largo del tiempo:
   1. Para Autoguardar: especifique un directorio para guardar automáticamente los archivos de imagen.
   2. Para la configuración de iluminación, determine de antemano la configuración de iluminación óptima para cada componente específico. Para el experimento descrito, utilice los siguientes tiempos de exposición: DIC 150 mseg, YFP 250 mseg, RFP 100 mseg.
   3. Para series temporales: configure una serie temporal para adquirir imágenes en los puntos temporales deseados en secuencia. Para obtener imágenes del ciclo de vida de S. venezuelae, seleccione un intervalo de tiempo de 40 minutos durante un período de 24 horas.
   4. Para posiciones de escenario y enfoque automático: escanee la cámara de cultivo moviendo el escenario y almacene las posiciones del escenario para cada posición de imagen de interés. Asegúrese de que las posiciones de una sola etapa estén lo suficientemente separadas para minimizar el fotoblanqueo y la fototoxicidad. Por lo general, use hasta 12 posiciones. Ejecute la rutina de enfoque automático para cada punto de tiempo para corregir la desviación focal lenta. Si está disponible en el software de control del microscopio, establezca la estrategia de enfoque automático en "actualización de superficie local mediante enfoque automático de hardware". Una vez verificadas las coordenadas Z de las posiciones de la platina seleccionadas, active el enfoque automático del hardware.
8. Inicie el experimento de lapso de tiempo en el software de control del microscopio.
9. Compruebe que todas las posiciones de la etapa siguen enfocadas en puntos posteriores. Para experimentos de lapso de tiempo que duran varias horas, ocasionalmente observamos una desviación de etapa incluso cuando usamos el enfoque automático. Si es necesario volver a enfocar las posiciones de la etapa, detenga el experimento en un momento adecuado, ajuste el enfoque y reinicie el experimento dentro del intervalo de tiempo de imagen definido.
10. Detenga la adquisición de imágenes después de 24-30 horas o cuando las hifas en la región de interés se hayan diferenciado en esporas. Luego, detenga el programa de flujo en el software y desmonte el dispositivo microfluídico.
11. Prepare la placa microfluídica usada para el almacenamiento a corto plazo. Retire los medios restantes del pocillo 1 al 6, vacíe el pozo de desechos 7 y el pozo de carga de celdas 8. En condiciones estériles, vuelva a llenar los pocillos usados del carril "A" y los pocillos de los carriles no utilizados ("B" a "D") en la placa con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Sellar la placa con parafilm para evitar que se seque y conservar a 4 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa B04A CellAsic ONIX para células bacterianas	Merck-Millipore	B04A-03-5PK	Placas de cultivo microfluídico
Sistema de perfusión microfluídica CellAsic ONIX y ONIX FG (versión 5.0.2)	Merck-Millipore	EV-262	La última versión de ONIX (julio de 2015) y las instrucciones sobre cómo usar el programa se pueden encontrar aquí: http://www.merckmillipore.com
Microscopio Axio Observer.Z1	Zeiss	431007-9902-000	Microscopio de campo amplio invertido totalmente automatizado y motorizado
Incubadora XL multi S1 con módulo de temperatura S1 y unidad de calentamiento XL S2	Zeiss	411857-9061-000	Cámara ambiental que rodea el microscopio
Objetivo Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC	Zeiss	420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2	Hamatsu: Fotónica K.K.	C11440-22CU
Iluminador HXP 120V	Zeiss	423013-9010-000
Juego de filtros FL 46 HE YFP sin cambio	Zeiss	489046-9901-000	Juego de filtros fluorescentes, excitación 500/25 nm, emisión 535/30 nm
Juego de filtros FL 63 HE RFP sin desplazamiento	Zeiss	489063-0000-000	Juego de filtros fluorescentes, excitación 572/25 nm, emisión 629/30 nm
Marco de montaje K-M para placas multipocillos	Zeiss	000000-1272-644	Soporte de platina para placa microfluídica
ZEN pro 2012	Zeiss	410135-1002-120	Software de control de microscopios
Lapso de tiempo del módulo ZEN	Zeiss	410136-1031-110	Módulo de software para configurar experimentos de microscopía de lapso de tiempo
Mosaicos/posiciones del módulo ZEN	Zeiss	410136-1025-110	Módulo de software para guardar posiciones específicas de la etapa (xzy)
Fiji	Paquete de software de código abierto	http://fiji.sc/Fiji	Generación de películas time-lapse
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Sigma	P4417-100TAB	Se utiliza para rellenar pozos de entrada de carriles no utilizados en placas B04A con el fin de preparar la placa para el almacenamiento a corto plazo.
SV60	Colección de variedades John Innes Centre		Cepa de S. venezuelae que expresa divIVA-mcherry y ftsZ-ypet