Comportamiento de enjambre de Pseudomonas aeruginosa bajo estrés antibiótico

Resumen

Fuente: Bru, J., et al., Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra el procedimiento para analizar el comportamiento de enjambre de Pseudomonas aeruginosa mediante la observación del crecimiento bacteriano desde un cultivo central hacia puntos satélite que contienen el mismo cultivo mezclado con un antibiótico, utilizando una configuración de placa de agar e imágenes de lapso de tiempo.

Protocolo

1. Crecimiento de P. aeruginosa y condiciones de siembra

1. Prepare 400 ml de caldo de lisogenia (LB) agregando 10 g de mezcla en polvo LB-Miller a 400 ml de ddH₂O. Agregue 8 g adicionales de agar para placas de Petri de agar LB al 2%. Autoclave para esterilizar.
2. Vierta 20 ml de medio de agar LB fundido en placas de Petri de 10 cm de diámetro y déjelas solidificar a temperatura ambiente durante la noche. Almacenar el medio líquido a temperatura ambiente y las placas de agar a 4 °C.
3. Rayar P. aeruginosa en una placa de Petri de agar LB de un caldo congelado almacenado a -80 °C utilizando asas estériles o palitos de madera. Incubar la placa de Petri boca abajo durante la noche a 37 °C. Almacenar la placa de agar LB a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
4. Recoger una sola colonia de la placa de Petri con un asa estéril o un palo de madera, inocularla en medio LB de 2 ml e incubar el cultivo hasta la saturación durante la noche (16-18 h) a 37 °C en un tambor de rodillos a 100 rpm.
5. Pipetee 5 μL de cultivo nocturno del paso 1.4 con una pipeta P20 y coloque en el centro de la placa de agar de enjambre acercándose a la punta de la pipeta en un ángulo (10-45°) de 2,5 cm por encima del área de manchado, pipeteando hasta el primer paso y tocando el agar solo con la gota de líquido (Figura 1B).
   1. Evite tocar el agar con la punta de la pipeta, ya que esto puede dañar el agar. Use una plantilla para colocar el lugar de manera consistente en diferentes placas de agar de enjambre.
6. Para tratamientos con antibióticos, mezcle 30 μL de cultivo nocturno de P. aeruginosa del paso 1.4 con 6 μL de gentamicina 3 mg/mL, 10 μL de kanamicina 100 mg/mL o 7,5 μL de fosfomicina 100 mg/mL. Continúe inmediatamente con el siguiente paso.
   1. Pipetear 6 μl de P. aeruginosa tratada con antibióticos utilizando una pipeta P20 y localizar en 6 posiciones satélite equidistantes en un círculo concéntrico de 2,8 cm de radio alrededor del centro de la placa acercándose a la punta de la pipeta en un ángulo (10 a 45°) 2,5 cm por encima del área de manchado, pipeteando hasta el primer tope, y tocar el agar solo con la gota líquida (Figura 1D).
   2. Evite tocar el agar con la punta de la pipeta, ya que esto puede dañarlo. Use una plantilla de emplatado para mantener la consistencia.
7. Reemplace las tapas transparentes de la placa de Petri con tapas negras (Figura 2A).
8. Coloque las placas de agar de enjambre en un escáner en una incubadora a 37 °C con un baño de agua de 10 L para mantener una humedad del 75% (Figura 1E, Figura 2B). CAUTELA: No moleste las células manchadas en las placas de agar de enjambre. Mantenga los platos hacia arriba en todo momento.

Resultados

Figura 1: Esquema del ensayo de enjambre de P. aeruginosa y respuesta colectiva al estrés. (A) Las células de P. aeruginosa se cultivan durante la noche (16-18 h a OD_600<...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
Bacto agar, deshidratado	BD Difco	214010	Para placa de agar LB y placa de agar de enjambre
Casaminoácidos	BD Difco	223050	Para medios de enjambre
D-Glucosa	Fisher Chemical	D16500	Dextrosa. Para medios de enjambre
Sal disódica de fosfomicina	Industria química de Tokio	F0889	Concentración de stock: 200 mg / mL. Disuelto en ddH₂O
Sulfato de gentamicina	Sigma-Aldrich	G1914	Concentración de stock: 3 mg / mL. Disuelto en ddH₂O
Sulfato de kanamicina	Sigma-Aldrich	60615	Concentración de stock: 100 mg / mL. Disuelto en ddH₂O
LB-Miller	BD Difco	244620	Para caldo LB y placas de agar LB
Sulfato de magnesio heptahidratado	Sigma-Aldrich	230391	Para medios de enjambre
Cepas
Pseudomonas aeruginosa	Laboratorio de Siryaporn	AFS27E.118	Cepa PA14
Suministros
Papel de lija de óxido de aluminio	3M	150 Multa	Para tapas negras
Tela negra	Joann	PRD7089	Tela negra
Pintura en aerosol negra	Krylon	5592 Negro mate	Para tapas negras
Matraz Erlenmeyer	Kimax	26500	250 ml
Botellas de almacenamiento de vidrio	Pyrex	13951L	250 ml, 500 ml, 1000 ml
Bridas de 8 pulgadas	Gardner Bender	E173770	Para unir tela negra mate
Placas de Petri (100 mm x 15 mm)	Pescador	FB0875712	Placas de poliestireno de 100 x 15 mm
Palos de madera	Pescador	23-400-102	Para rayar e inocular bacterias
Equipo
Autoclave	Industrias de forja de mercado	STM-E	Para reactivos esterilizantes
Pipeta de 25 ml	USA Scientific, Inc.	1072-5410	Para pipetear 20 ml para placas de agar de enjambre
Deshumidificador	Frigidaire	FAD704DWD 70 pintas	Para mantener la humedad relativa de la habitación en aproximadamente el 45%
Incubadora	VWR	89032-092	Para el crecimiento de bacterias a 37 °C
Baño de agua Isotemp	Pescador	15-462-21Q	Para enfriar medios hasta 55 °C
Campana de flujo laminar	La compañía panadera	SG603A	Para secar placas
Pipeta P-20	Gilson	F123601	Manchado en placas de agar de enjambre
Controlador de pipetas	BrandTech	Accu-Jet	Para pipetear 20 ml para placas de agar de enjambre