Inducción de la diferenciación de Vibrio parahaemolyticus en células de enjambre

Resumen

Fuente: Heering, J., et al. Inducción de diferenciación celular e imágenes unicelulares de células nadadoras y enjambres de Vibrio parahaemolyticus . J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra la inducción de la diferenciación celular de enjambre en Vibrio parahaemolyticus utilizando un medio de agar especialmente preparado. Al manipular señales ambientales como el agotamiento del hierro, la suplementación con calcio y el contacto con la superficie, las bacterias son estimuladas para hacer la transición de su forma de nadador a células de enjambre alargadas con flagelos laterales. Estas células diferenciadas se extienden por la superficie sólida, formando llamaradas de enjambre características que significan un cambio morfológico exitoso.

Protocolo

1. Inducción de la diferenciación celular del enjambre

NOTA: Los siguientes pasos describen cómo inducir la diferenciación de V. parahaemolyticus en su ciclo de vida celular de enjambre y cómo estimular la proliferación en superficies sólidas.

1. Suspender 4 g de agar Heart Infusion (HI) en 100 mL ddH₂O para preparar las placas de enjambre.

2. Hierva con cuidado la solución de agar HI en el microondas y agite la botella de vez en cuando hasta que el polvo se disuelva. Autoclave a 121 °C durante 20 min.

3. Después del autoclave, enfriar el agar HI a 60-65 °C. Añadir 2,2'-Bipiridilo a una concentración final de 50 μM (solución madre de 50 mM en etanol al 100%). Añadir CaCl₂ a una concentración final de 4 mM (solución madre de 4 M en ddH₂O). Si es necesario, agregue antibióticos a la solución para mantener los plásmidos.

NOTA: Si planea usar un plásmido inducible, agregue un agente inductor a su concentración final.

PRECAUCIÓN: 2,2'-Bipiridil: Toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación). Use guantes y gafas de seguridad cuando manipule este químico.

4. Vierta 30 - 35 ml de la solución final de agar HI en una placa de Petri redonda de 150 mm y deje que el agar se solidifique.

5. Justo antes de detectar el cultivo celular, seque la placa de agar a 37 °C durante al menos 10 minutos (o hasta que hayan desaparecido los residuos líquidos, pero ya no) en posición vertical con la tapa abierta.
NOTA: Los tiempos de secado dependen en gran medida de la incubadora utilizada y las placas muy secas no permitirán el enjambre de V. parahaemolyticus. (¡Este paso es muy importante!) Los platos deben usarse frescos y no deben tener más de 2 a 3 h. Los platos viejos estarán demasiado secos para estimular el enjambre.

6. Inocular una pequeña cantidad de células del borde de una sola colonia en 5 ml de caldo Luria-Bertani (LB). Incubar el cultivo agitando a 37 °C hasta alcanzar OD₆₀₀ = 0,8, suele tardar alrededor de 2-3 horas. Después de eso, las células están listas para ser detectadas en placas de agar de enjambre HI.

7. Detecte 1 μL de cultivo celular en el centro de una placa de enjambre de agar HI (Figura 1A).

8. Deje que la mancha se seque (Figura 1B).

9. Selle la placa con cinta de plástico transparente y asegúrese de que esté firmemente sujeta, de lo contrario podría desprenderse durante la incubación durante la noche (Figura 1C).

NOTA: Es muy importante que el sellado sea perfecto. Evite la formación de burbujas de aire y pliegues en la cinta cuando se aplica.

10. Incubar la placa a 24 °C durante la noche. Esto dará como resultado la formación de una colonia de enjambre de V. parahaemolyticus con llamaradas de enjambre que se extienden desde la periferia de la colonia de enjambre (Figura 2).

Resultados

Figura 1: Inducción de la diferenciación del enjambre y preparación de células para imágenes de microscopía. Visualización simplificada del flujo de trabajo para producir células de enjambre de V. parahaemolyticus y l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Componentes multimedia
LB medio	Roth	Formato X968.3
Agar Difco, granulado	BD	214510	Para la preparación de agar LB con medio LB
Agar de infusión de corazón Difco	BD	244400	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
Agarose NEEO, ultra calidad	Roth	2267.3	Para la preparación de almohadillas de agarosa microscópicas
Aditivos
2,2'-Bipiridilo	Sigma Aldrich	D216305-25G	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
Cloruro de calcio dihidrato	Roth	5239.1	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
Hardware
Placa de Petri 150 mm x 20 mm con levas	Sarstedt	82.1184.500	Para la preparación de placas de enjambre de agar HI
kelvitron t (B 6420)	Heraeus	-	Se utiliza para secar placas de enjambre de agar HI