Este video demuestra un método para monitorear la infección bacteriana y la administración de proteínas efectoras en células vegetales utilizando la complementación de proteína fluorescente verde de supercarpeta dividida (sfGFP) combinada con microscopía confocal. El enfoque permite una visualización precisa de la translocación efectora en el citosol de la célula huésped.
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Artículo de método
Monitoreo de infecciones bacterianas y administración de proteínas efectoras en células vegetales
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26 de septiembre de 2025
En este artículo
Resumen
Protocolo
NOTA: Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
1. Preparación de materiales vegetales (4 semanas)
- Preparación para las plantas de Nicotiana benthamiana
- Siembre 2 semillas de N. benthamiana en la superficie del suelo de cada maceta, cubra la bandeja con una cúpula de plástico y deje que las semillas germinen en una cámara de crecimiento de 25 ° C y 60% de humedad con un ciclo de fotoperíodo claro / oscuro de 16/8 h.
- Después de dos semanas, elija y deseche la plántula más pequeña en cada maceta. Continúe cultivando plantas en las mis....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Líneas transgénicas de Arabidopsis | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. y Dinesh-Kumar, S. P. Monitoreo espaciotemporal de efectores de Pseudomonas syringae a través de la secreción de tipo III utilizando fragmentos de proteínas fluorescentes divididas. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CITO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Plásmido sfGFP1-10OPT dirigido a orgánulos | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. y Dinesh-Kumar, S. P. Monitoreo espaciotemporal de efectores de Pseudomonas syringae a través de la secreción de tipo III utilizando fragmentos de proteínas fluorescentes divididas. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CITO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCereza1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CITO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| Vector compatible con Gateway etiquetado con sfGFP11 para sistema de administración de efectores basado en T3SS | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. y Dinesh-Kumar, S. P. Monitoreo espaciotemporal de efectores de Pseudomonas syringae a través de la secreción de tipo III utilizando fragmentos de proteínas fluorescentes divididas. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la kanamicina (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la kanamicina (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la kanamicina (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la kanamicina (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml) |
| Cepas bacterianas | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz y Jeff Schell, El promotor del gen 5 de TL-DNA controla la expresión específica del tejido de genes quiméricos transportados por un nuevo tipo de vector binario de Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistente a la gentamicina (50 ug/ml) y a la rifampicina (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomate CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Las deleciones en el repertorio de Pseudomonas syringae pv. Los genes efectores de secreción tipo III del tomate DC3000 revelan superposición funcional entre los efectores. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistente a la rifampicina (100 ug/ml) | ||
| Componentes multimedia | |||
| Medios de germinación de plantas | Añadir 2,165 g/L de polvo de Murashige & Skoog, 10 g/L de sacarosa al agua. Ajustar a pH 5,8 y añadir 2,2 g/L de phytagel. Autoparto. | ||
| Murashige & Skoog medium incluyendo vitaminas | Bioquímica Duchefa | M0222 | Conservar a 4 °C. |
| Sacarosa | Bioquímica Duchefa | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Medios LB | Añadir 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCl al agua. Para medios sólidos, agregue 15 g / L de micro agar. Autoclave. Deje que la solución se enfríe a 55 °C y agregue antibióticos si es necesario. | ||
| Triptona | BD Biociencia | 211705 | |
| Extracto de levadura | BD Biociencia | 212750 | |
| NaCl | Bioquímica Duchefa | S0520 | |
| Micro agar | Bioquímica Duchefa | M1002 | |
| Medios de comunicación de King's B | 10 g/L de proteasa peptona #2, 1,5 g/L de K2HPO4 anhidro, 15 g/L de agar a agua. Autoclave. Enfriar a 55 °C y añadir 15 ml/L de glicerol estéril, 5 ml/L de MgSO4 al medio. Agregue antibióticos si es necesario. | ||
| Proteosa peptona | BD Biociencia | 212120 | |
| Anhidro K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glicerol | Bioquímica Duchefa | G1345 | |
| MgSO:4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Biociencia | 214010 | |
| Medios líquidos de manitol-glutamato (MG) | Añadir 10 g/L de manitol, 2 g/L de ácido L-glutámico, 0,5 g/L de KH2PO4, 0,2 g/L de NaCl y 0,2 g/L de MgSO4 al agua. Ajustar a pH 7 | ||
| Manitol | Bioquímica Duchefa | M0803 | |
| Ácido L-glutámico | Bioquímica Duchefa | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Tampón de infiltración | 10 mM MES (ácido 2-(N-morfolino)-etano sulfónico), 10 mM MgCl2, 150 μM acetosiringona. pH 5,6; Prepare un tampón nuevo antes de usarlo. | ||
| MES | Bioquímica Duchefa | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5,6) de caldo en agua. Esterilizar con filtro. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Preparar 100 mM de caldo en agua. Autoclave. |
| Acetosiringona | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM de stock en DMSO. |
| Equipos/materiales de microscopio confocal | |||
| Sistema confocal de escaneo láser 710 | Carl Zeiss | ||
| Microscopio invertido Axio observer Z1 | Carl Zeiss |
