Monitoreo de infecciones bacterianas y administración de proteínas efectoras en células vegetales

Resumen

Fuente: Lee, H. et. al., Sistema de proteínas fluorescentes verdes divididas para visualizar efectores entregados por bacterias durante la infección. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra un método para monitorear la infección bacteriana y la administración de proteínas efectoras en células vegetales utilizando la complementación de proteína fluorescente verde de supercarpeta dividida (sfGFP) combinada con microscopía confocal. El enfoque permite una visualización precisa de la translocación efectora en el citosol de la célula huésped.

Protocolo

NOTA: Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Preparación de materiales vegetales (4 semanas)

1. Preparación para las plantas de Nicotiana benthamiana
   1. Siembre 2 semillas de N. benthamiana en la superficie del suelo de cada maceta, cubra la bandeja con una cúpula de plástico y deje que las semillas germinen en una cámara de crecimiento de 25 ° C y 60% de humedad con un ciclo de fotoperíodo claro / oscuro de 16/8 h.
   2. Después de dos semanas, elija y deseche la plántula más pequeña en cada maceta. Continúe cultivando plantas en las mismas condiciones de crecimiento que se aplicaron para la germinación en el paso 1.1.1. Añadir 1 L de agua por bandeja cada dos días.
      NOTA: Las condiciones de crecimiento de las plantas pueden variar entre laboratorios. Por lo tanto, siga el protocolo de riego regular para cultivar la planta en condiciones saludables.
   3. En una semana, transfiera las plantas a una nueva bandeja y colóquelas con el espacio adecuado para un mayor crecimiento. Siga cultivando las plantas en las condiciones descritas en el paso 1.1.1 hasta que estén listas para ser infiltradas a las 4 semanas de edad.
      NOTA: El crecimiento de las plantas puede diferir según las condiciones de crecimiento en los laboratorios. Por lo general, encontramos que las plantas de N. benthamiana de 4 semanas tienen alrededor de seis hojas.
2. Preparación para plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana
   1. Consulte la Tabla de Materiales y solicite las semillas transgénicas de Arabidopsis .
   2. Remoje ~ 50 - 100 semillas transgénicas de Arabidopsis en 1 ml de agua destilada y guárdelas a 4 ° C durante 3 días en la oscuridad para sincronizar el inicio de la germinación.
   3. Siembre ~ 2 - 3 semillas en la superficie del suelo de una bandeja para plantas y cubra la bandeja con una cúpula de plástico. Deja que las semillas germinen a 23 °C, 60% de humedad con un ciclo fotoperiódico claro/oscuro de 10/14 h.
      NOTA: Las semillas deben ser homocigotas. Sin embargo, recomendamos volver a confirmar la presencia del transgén en el lote. En este caso, esterilice las semillas lavándolas con etanol al 70% durante 2 min, lejía al 50% (aproximadamente hipoclorito al 2%) que contenga Triton X-100 al 0,05% durante 5 min. Seguido de lavado 5 - 6 veces con agua estéril de doble destilación (ddH₂O). Después de la esterilización, estratificar a 4 °C durante 3 días y colocarlas en un medio de germinación vegetal que contenga 25 μg/L de higromicina B para seleccionar las plantas transgénicas.
   4. Después de una semana, deje solo una planta por tapón y continúe cultivando plantas en las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para el paso 1.2.3.
      NOTA: Se utilizaron plantas de cuatro semanas de edad para la infección por Pseudomonas syringae . Riegue las plantas cada dos días para mantenerlas saludables.

2. Preparación del cultivo de Pseudomonas (~1 semana)

1. Construcción del plásmido para la transformación de Pseudomonas
   1. Consulte la Tabla de materiales y solicite los vectores deseados del vector del sistema de administración de efectores basado en el sistema de secreción tipo III (T3SS).
   2. Inserte el gen efector de interés en el vector de administración efector mediante clonación de recombinación específica del sitio.
      NOTA: Al monitorear la localización subcelular de la proteína efectora de longitud completa, coloque el gen de longitud completa en pBK-GW-1-2 o pBG-GW-1-2. También es posible elegir pBK-GW-1-4 o pBG-GW-1-4 que contiene 2x sfGFP11 (11ª β hebra de sfGFP) para aumentar la señal de fluorescencia. En el caso de un efector parcial que carezca de un péptido señal, use pBK-GW-2-2 o pBK-GW-2-4.
2. Transforme el plásmido que lleva un efector fusionado con la etiqueta sfGFP11 en P. syringae pv. El tomate (Pst) CUCPB5500 utilizando electroporación estándar.
   NOTA: Se pueden usar otras cepas de Pseudomonas si es necesario. El sistema de etiquetas sfGFP11 está construido para una amplia gama de vectores, y la expresión génica del efector está regulada por el promotor AvrRpm1, que es comparable con, por ejemplo, Pseudomonas fluorescens (EthAn).
3. Extienda las células bacterianas transformadas suavemente sobre la superficie de las placas de agar King's B que contienen 100 μg/ml de rifampicina y 25 μg/ml de kanamicina o 25 μg/ml de gentamicina. Incubar a 28 °C durante 2 días.
4. Inocular una colonia en medios líquidos de King's B con antibióticos apropiados para el vector utilizado, y cultivar las células durante la noche a 28 °C con agitación a 200 rpm.
5. Haz un caldo de glicerol. Añadir glicerol esterilizado en autoclave hasta una concentración final del 50% y guardar a -80 °C.

3. Expresión transitoria de sfGFP1-10^OPT dirigida a orgánulos (1-10^ª β hebra de sfGFP) en N. benthamiana (4 días)

1. Preparación del cultivo de Agrobacterium
   1. Solicite los vectores deseados de plásmidos sfGFP1-10^OPT dirigidos a orgánulos (consulte la Tabla de materiales).
   2. Transformar los plásmidos en células de la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens . Cultive las células en medio de agar Luria-Bertani (LB) suplementado con 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina a 28 °C durante 2 días.
   3. A partir de una sola colonia en el medio de agar LB, inocular las células en 5 ml de medio LB líquido suplementado con 50 μg/ml de kanamicina y 50 μg/ml de rifampicina. Cultive las células durante la noche a 28 ° C agitando a 200 rpm.
   4. Cosechar las células por centrifugación a 3.000 x g durante 10 min. Vierta el medio sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de tampón de infiltración recién hecho.
   5. Mida la cantidad de Agrobacterium obteniendo el valor de densidad óptica (OD) a una absorbancia de 600 nm (Abs 600 nm). Ajuste el OD₆₀₀ de las bacterias a 0,5 con tampón de infiltración.
      NOTA: 1 ml de suspensión es suficiente para infiltrarse en dos puntos.
   6. Deje el cultivo a temperatura ambiente en un balancín suave durante 1 a 5 h antes de la infiltración.
   7. Haga un agujero en el centro de las hojas para infiltrarlo con una punta de 10 μL. Utilice una jeringa sin aguja de 1 ml para infiltrarse en las suspensiones de Agrobacterium . Inyecte con cuidado y lentamente unos 500 μl de las suspensiones preparadas en el paso 3.1.5 en el lado adaxial de la hoja a través de la jeringa. Repita la infiltración en al menos tres plantas diferentes para réplicas experimentales.
      NOTA: Por razones de salud y seguridad, se debe usar protección ocular durante la infiltración.
   8. Limpie la suspensión bacteriana restante en las hojas y marque el límite de la región infiltrada.
   9. Mantenga las plantas infiltradas en las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para el paso 1.1.1 durante 2 días.

4. Inoculación de Pseudomonas (4 días)

1. Raspe la cepa transformada de Pseudomonas de la reserva de glicerol en el paso 2.5 en medios de agar King's B con los antibióticos apropiados a 28 ° C durante 2 días.
   NOTA: La salud de Pseudomonas es muy crítica. Si las colonias no se forman bien, vuelva a rayar las células o propague las células en el medio líquido del rey antes de continuar.
2. Inocular un bucle lleno de células de Pseudomonas en medios líquidos de manitol-glutamato (MG) a 28 °C agitando a 200 rpm durante la noche.
3. Cosechar las células por centrifugación a 3.000 x g durante 10 min. Vierta el medio sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento en 10 mM MgCl₂ y ajuste el OD₆₀₀ a 0,02 (1 x 10⁷ ufc/ml) para las hojas de N. benthamiana y a 0,002 (1 x 10⁶ ufc/ml) para las hojas de Arabidopsis.
4. Para N. benthamiana, infiltrar la suspensión de Pseudomonas en el área de las hojas donde se infiltró la construcción de Agrobacterium portadora de sfGFP1-10^OPT 2 días antes (como en el paso 3.1.7). Para la Arabidopsis transgénica sfGFP1-10^OPT, infíltese la suspensión de Pseudomonas en dos hojas cortas de 4 semanas de edad cultivadas durante el día.
   NOTA: Se necesitan al menos tres plantas para réplicas experimentales.

5. Observación de la señal sfGFP mediante microscopía confocal (1 día)

1. Corta el disco de la hoja de las hojas inoculadas con Pseudomonas. En momentos específicos después de la infiltración de Pseudomonas, obtenga imágenes de dos discos de² hojas de 2 cm de la planta individual utilizando un sistema confocal de escaneo láser con objetivo de inmersión en agua C-Apochromat de apertura numérica (NA) de 40X / 1.2 u objetivo de inmersión en aceite C-Apochromat de 63X / 0.8 NA. Para evitar que las células muertas mueran por heridas, observe las células lejos del orificio de infiltración.
2. Comience la observación con una configuración de baja potencia del láser de argón de 488 nm. Aumente la potencia del láser para detectar sfGFP.
   NOTA: Por lo general, usamos del 2 al 15% de la intensidad del láser para detectar la señal de fluorescencia. Sin embargo, la potencia del láser y la configuración de detección deben ajustarse en función del sistema de microscopía del usuario. Aquí, los filtros de emisión se ajustaron a 520 - 550 nm. Las células muertas a menudo emiten autofluorescencia bajo la excitación láser de 488 nm. Por lo tanto, como control negativo, el mismo efector sin la etiqueta sfGFP11 debe infiltrarse y observarse en las mismas condiciones de observación. Además, la alta excitación del láser puede inducir la autofluorescencia de la clorofila. Por lo tanto, ajuste la intensidad del láser utilizando las células vegetales de control para no inducir la autofluorescencia de la clorofila.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Líneas transgénicas de Arabidopsis			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. y Dinesh-Kumar, S. P. Monitoreo espaciotemporal de efectores de Pseudomonas syringae a través de la secreción de tipo III utilizando fragmentos de proteínas fluorescentes divididas. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CITO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Plásmido sfGFP1-10OPT dirigido a orgánulos			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. y Dinesh-Kumar, S. P. Monitoreo espaciotemporal de efectores de Pseudomonas syringae a través de la secreción de tipo III utilizando fragmentos de proteínas fluorescentes divididas. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CITO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCereza1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CITO-sfCFP1-10	Addgene	97405
Vector compatible con Gateway etiquetado con sfGFP11 para sistema de administración de efectores basado en T3SS	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. y Dinesh-Kumar, S. P. Monitoreo espaciotemporal de efectores de Pseudomonas syringae a través de la secreción de tipo III utilizando fragmentos de proteínas fluorescentes divididas. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la kanamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la kanamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la kanamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la kanamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml)
Cepas bacterianas
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz y Jeff Schell, El promotor del gen 5 de TL-DNA controla la expresión específica del tejido de genes quiméricos transportados por un nuevo tipo de vector binario de Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistente a la gentamicina (50 ug/ml) y a la rifampicina (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomate CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Las deleciones en el repertorio de Pseudomonas syringae pv. Los genes efectores de secreción tipo III del tomate DC3000 revelan superposición funcional entre los efectores. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistente a la rifampicina (100 ug/ml)
Componentes multimedia
Medios de germinación de plantas			Añadir 2,165 g/L de polvo de Murashige & Skoog, 10 g/L de sacarosa al agua. Ajustar a pH 5,8 y añadir 2,2 g/L de phytagel. Autoparto.
Murashige & Skoog medium incluyendo vitaminas	Bioquímica Duchefa	M0222	Conservar a 4 °C.
Sacarosa	Bioquímica Duchefa	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Medios LB			Añadir 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCl al agua. Para medios sólidos, agregue 15 g / L de micro agar. Autoclave. Deje que la solución se enfríe a 55 °C y agregue antibióticos si es necesario.
Triptona	BD Biociencia	211705
Extracto de levadura	BD Biociencia	212750
NaCl	Bioquímica Duchefa	S0520
Micro agar	Bioquímica Duchefa	M1002
Medios de comunicación de King's B			10 g/L de proteasa peptona #2, 1,5 g/L de K2HPO4 anhidro, 15 g/L de agar a agua. Autoclave. Enfriar a 55 °C y añadir 15 ml/L de glicerol estéril, 5 ml/L de MgSO4 al medio. Agregue antibióticos si es necesario.
Proteosa peptona	BD Biociencia	212120
Anhidro K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glicerol	Bioquímica Duchefa	G1345
MgSO:4	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Biociencia	214010
Medios líquidos de manitol-glutamato (MG)			Añadir 10 g/L de manitol, 2 g/L de ácido L-glutámico, 0,5 g/L de KH2PO4, 0,2 g/L de NaCl y 0,2 g/L de MgSO4 al agua. Ajustar a pH 7
Manitol	Bioquímica Duchefa	M0803
Ácido L-glutámico	Bioquímica Duchefa	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
Tampón de infiltración			10 mM MES (ácido 2-(N-morfolino)-etano sulfónico), 10 mM MgCl2, 150 μM acetosiringona. pH 5,6; Prepare un tampón nuevo antes de usarlo.
MES	Bioquímica Duchefa	M1503	Prepare 100 mM (pH 5,6) de caldo en agua. Esterilizar con filtro.
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Preparar 100 mM de caldo en agua. Autoclave.
Acetosiringona	Sigma-Aldrich	D134406	Prepare 150 mM de stock en DMSO.
Equipos/materiales de microscopio confocal
Sistema confocal de escaneo láser 710	Carl Zeiss
Microscopio invertido Axio observer Z1	Carl Zeiss