Aislamiento de colonias bacterianas dirigidas mediante degradación de hidrogel con patrón de luz

Abstract

Fuente: Fattahi, N., et al. Interfaces de hidrogel fotodegradables para la detección, selección y aislamiento de bacterias. J. Vis. Exp. (2021).

Este video demuestra la extracción de colonias bacterianas de un hidrogel fotodegradable utilizando luz ultravioleta. Se selecciona una colonia específica y se diseña una exposición a la luz con patrón para iniciar la degradación localizada del hidrogel. Después de ajustar la intensidad y la duración de la luz, se aplica la luz ultravioleta, liberando la colonia. Luego, la colonia se aspira a través de un tubo y se transfiere a un tubo para su análisis posterior.

Protocol

1. Cepas bacterianas y protocolos de cultivo

1. Colonias de bacterias en placas de agar complementadas con medios de crecimiento apropiados. En este reporte, B. subtilis (cepa 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) se cultiva en ATGN (0,079 M KH₂PO₄ (fosfato de dihidrógeno potásico), 0,015 M (NH₄)₂SO₄ (sulfato de amonio), 0,6 mM MgSO₄·7H₂O (sulfato de magnesio heptahidratado), 0,06 mM CaCl₂·2H₂O (cloruro de calcio dihidratado), 0,0071 mM MnSO₄·H₂O (sulfato de manganeso (II) monohidratado), 0,125 M FeSO₄·7H₂O (sulfato ferroso heptahidratado), 28 mM de glucosa, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L de agar) placas de agar suplementadas con 100 μg/mL de espectinomicina y E. coli (cepa 25922, ATCC) en placas de agar ATGN suplementadas con 100 μg/mL de ampicilina.
   NOTA: Los informes anteriores de encapsulación y liberación de hidrogel con estos materiales utilizaron células C58 de A. tumefaciens
2. Elija las colonias deseadas de las placas de agar ATGN y comience los cultivos durante la noche. Para las cepas de E. coli y B. subtilis utilizadas aquí, cultivar a 37 °C agitando a 215 rpm en medio líquido ATGN durante 24 h. Almacene los cultivos celulares en glicerol al 50% a -80 °C hasta su uso futuro.
3. Recoger colonias de ambas cepas de las reservas de glicerol utilizando asas de inoculación estériles e incubar en medios líquidos ATGN durante 24 h a 37 °C y 215 rpm.

2. Preparación del material necesario para la formación de hidrogeles

1. Fotodegradable PEG-o-NB-diacrilato (síntesis de poli(etilenglicol)-orto-nitrobencil-diacrilato)
   NOTA: La síntesis interna del diacrilato PEG-o-NB ha sido bien descrita y reportada previamente. Alternativamente, debido a que la síntesis es rutinaria, se puede subcontratar desde una instalación de síntesis química.
2. Búfer de reticulación
   1. Tome la receta del medio seleccionado para la cepa bacteriana y prepare el medio con 2x nutrientes. Agregue fosfato, por ejemplo, NaH₂PO₄ (dihidrogenofosfato de sodio), al medio hasta una concentración final de 100 mM. Luego, ajuste el valor de pH a 8 usando 5 M NaOH (hidróxido de sodio) (acuoso).
   2. Esterilice la solución tampón y guárdela a -20 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: Omita los metales de transición presentes en el medio, ya que estos metales catalizan la oxidación de los tioles a disulfuros.
3. Solución de diacrilato PEG-o-NB
   1. Por cada mg de alícuota de diacrilato de PEG-o-NB (3.400 Da de peso molecular) en polvo, añadir 3,08 μL de agua ultrapura hasta alcanzar una concentración de 49 mM de diacrilato de PEG-o-NB (concentración de acrilato de 98 mM).
   2. Agite la solución hasta que esté bien mezclada y guárdela a -20 °C hasta su uso posterior.
4. Solución de PEG-tiol de 4 brazos
   1. Para la preparación de PEG-tiol de 4 brazos (peso molecular de 10.000 Da), agregue 4 μL de agua ultrapura por mg de polvo para alcanzar una concentración de 20 mM (80 mM de concentración de tiol).
   2. Agite esta solución hasta que esté bien mezclada y guárdela a -20 °C hasta su uso posterior.

3. Preparación de cubreobjetos perfluoroalquilados (no reactivos)

1. Coloque hasta 5 portaobjetos de vidrio (25 mm x 75 mm x 1 mm) dentro de un sobre de polipropileno. Sonicar los portaobjetos con una solución detergente al 2% (p/v) (Tabla de materiales) durante 20 min.
2. Enjuague los portaobjetos tres veces con agua ultrapura, luego sonique los portaobjetos en agua durante 20 minutos. Seque los portaobjetos con un chorro de N₂ (nitrógeno).
3. Limpiar con plasma (ver tabla de materiales) en ambos lados de los portaobjetos de vidrio de acuerdo con el protocolo de la sección 4.1 durante 2 min.
4. Vuelva a colocar los portaobjetos limpios con plasma en el sobre de portaobjetos y llene el recipiente con una solución al 0,5% (v/v) de tricloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluorooctil)silano en tolueno. Deje que estos portaobjetos de vidrio se funcionalicen durante 3 h a temperatura ambiente (RT).
5. Después de funcionalizar los portaobjetos, enjuague los portaobjetos dentro del sobre de portaobjetos, primero con tolueno y luego etanol (tres veces con cada solvente). A continuación, seque cada portaobjetos funcionalizado con un chorro de N₂.

4. Preparación de cubreobjetos (base) funcionalizados con tiol

1. Limpieza de los cubreobjetos de vidrio con un limpiador de plasma
   1. Coloque cubreobjetos de 18 mm x 18 mm en una placa de Petri. Luego, coloque la placa de Petri en una cámara de limpieza de plasma y encienda el limpiador de plasma.
   2. Encienda la bomba de vacío para limpiar el aire dentro de la cámara hasta que el manómetro marque 400 mTorr.
   3. Abra la válvula dosificadora para dejar entrar aire en la cámara hasta que el manómetro alcance una presión constante (800-1000 mTorr). Luego, seleccione RF con el modo "Hi" y exponga los cubreobjetos durante 3 minutos.
   4. Después de 3 minutos, apague el modo RF y la bomba de vacío.
   5. Saque la placa de Petri de la cámara, voltee los cubreobjetos, colóquelos nuevamente en la cámara al plasma y exponga el otro lado del cubreobjetos de vidrio.
   6. Repita los pasos 4.1.2-4.1.4 para limpiar el lado no tratado del cubreobjetos de vidrio con plasma.
   7. Después de completar el proceso, retire la placa de Petri de la cámara y apague el limpiador de plasma y la bomba de vacío.
2. Limpieza e hidroxilación de los cubreobjetos con solución de piraña
   NOTA: Los protocolos estándar de limpieza de pirañas se pueden utilizar para limpiar e hidroxilar los resbalones de vidrio. La solución de piraña es una mezcla 30:70 (v/v) de H₂O₂ (peróxido de hidrógeno) y H₂SO₄ (ácido sulfúrico). También se pueden usar métodos alternativos para limpiar cubreobjetos de vidrio.
   PRECAUCIÓN: La solución de piraña es fuertemente corrosiva y explosiva con disolventes orgánicos y debe manipularse con extrema precaución. Se deben implementar medidas de seguridad y contención adecuadas, como el uso de equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, delantal resistente a productos químicos, gafas de seguridad, protector facial, guantes de butilo resistentes a los ácidos). Toda la cristalería y las superficies de trabajo en contacto con la solución de piraña deben estar limpias, secas y libres de residuos orgánicos antes de su uso. La solución de piraña nunca debe almacenarse en un recipiente parcialmente cerrado o cerrado.
   1. Coloque un plato de vidrio limpio de 100 mm x 50 mm en un agitador magnético de placa calefactora con velocidad de agitación ajustable debajo de una campana extractora y agregue 14 ml de H₂SO₄ al plato.
   2. Coloque suavemente una pequeña barra de agitación magnética recubierta de teflón con pinzas recubiertas de teflón dentro del plato. Luego, gire el agitador lentamente para evitar salpicar el ácido.
   3. A continuación, agregue suavemente 6 ml de H₂O₂ al plato y deje que la solución se mezcle bien.
   4. Apague el agitador, luego retire la barra de agitación del plato con las pinzas. A continuación, coloque suavemente los cubreobjetos dentro del plato con las pinzas y ajuste la temperatura a 60-80 °C.
   5. Después de 30 minutos, retire suavemente los cubreobjetos con las pinzas y sumérjalos en agua desionizada (DI) dos veces para eliminar la solución residual de piraña.
   6. Después de enjuagar con agua, guarde los cubreobjetos en agua desionizada a temperatura temperatura previa hasta su uso posterior.
   7. Apague la placa calefactora y deje que la solución de piraña se enfríe.
   8. Para desechar la solución de piraña, coloque suavemente el plato de vidrio de 100 mm x 50 mm que contiene la solución de piraña enfriada en un vaso de precipitados de vidrio vacío más grande que tenga al menos 1,5 L de volumen. Luego agregue 1 L de agua para diluir y agregue bicarbonato de sodio en polvo para neutralizar. Tenga en cuenta que el bicarbonato de sodio causará burbujeo y generación de calor y debe agregarse muy lentamente; de lo contrario, el burbujeo puede provocar salpicaduras de ácido. Cuando la adición adicional de bicarbonato de sodio no cause burbujeo, verifique el pH con papel de pH para verificar que se haya neutralizado. Una vez que la solución se neutraliza y se enfría, se puede verter por el fregadero.
3. Funcionalización tiol de los cubreobjetos
   1. Preparar una solución al 5% (v/v) de 269 mM de solución de (3-mercaptopropilo) trimetoxisilano (MPTS) en tolueno seco.
   2. Agregue 10 ml de la solución a tubos de centrífuga cónicos individuales de 50 ml. Coloque un cubreobjetos limpio en cada tubo y sumérjalo en la solución.
      NOTA: Se utiliza un cubreobjetos por tubo de 50 ml para asegurar la tiolación de ambos lados del sustrato sin ser perturbado por otros sustratos.
   3. Después de 4 h, lave cada cubreobjetos (cuatro lavados por cubreobjetos) con tolueno, una mezcla de etanol 1:1 (v/v) y etanol.
      NOTA: Esto se hace sumergiendo cada cubreobjetos secuencialmente en tubos de centrífuga cónicos que contienen las soluciones mencionadas.
   4. Después de enjuagar el sustrato, sumérjalo en etanol y guárdelo a 4 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: Dependiendo del número de cubreobjetos, este método puede resultar laborioso debido al tratamiento de los cubreobjetos de uno en uno. Para cubreobjetos múltiples, se pueden usar frascos Columbia que se ajusten a varios cubreobjetos al mismo tiempo.

5. Fabricación de matrices de micropocillos de silicio

1. Recubrimiento de parileno: Utilice el protocolo estándar descrito en artículos de investigación anteriores para recubrir las obleas de silicio con parileno.
2. Microfabricación: Siga el protocolo descrito por Barua et al. para diseñar y fabricar la matriz de micropocillos. ​

6. Formación de hidrogel

1. Formación de hidrogel a granel en cubreobjetos de vidrio
   1. Solución precursora de hidrogel: Agregue 12,5 μl del tampón de reticulación a un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, seguido de 5,6 μl de solución de diacrilato PEG-o-NB. Por último, agregue 6,9 μL de solución de PEG-tiol de 4 brazos a la mezcla.
      NOTA: Agregar el tiol PEG de 4 brazos a la mezcla inicia la reacción de reticulación. Por lo tanto, la solución precursora de hidrogel debe usarse inmediatamente después de la mezcla.
   2. Para la encapsulación celular en la solución precursora de hidrogel, siga los pasos 6.1.3-6.1.9.
   3. Para la encapsulación celular, antes del paso 6.1.1, inocule el tampón de reticulación con la densidad celular deseada. Como se informó anteriormente19, se observó que la densidad celular de 7,26 × 10⁷ UFC/ml en el tampón de reticulación se correlaciona con una densidad de ~ 90 células/mm² encapsuladas a través del hidrogel.
   4. Coloque el cubreobjetos de base tiolado en una placa de Petri limpia. Coloque dos espaciadores (consulte la Tabla de materiales) en los dos lados opuestos del cubreobjetos.
      NOTA: La funcionalización tiol de los cubreobjetos es necesaria para la unión covalente del hidrogel a la superficie del cubreobjetos. Esto se hace a través de la reacción de los grupos tiol en la superficie y los grupos acrilato presentes en la solución precursora de hidrogel.
   5. Fije los espaciadores en el cubreobjetos de la base pegándolos con cinta adhesiva a la placa de Petri.
   6. Pipetee el volumen deseado de la solución precursora en un portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado no reactivo.
   7. Coloque el portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado en el cubreobjetos de la base (Figura 1C). Espere 25 minutos a temperatura media para que se complete la formación de hidrogel.
   8. Después de la gelificación, retire suavemente el portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado. El hidrogel permanecerá adherido al cubreobjetos de la base. ​
      NOTA: Para cubreobjetos de 18 mm x 8 mm para obtener una membrana de 12,7 μm de espesor, use ~ 7 μL de la solución precursora (Figura 1A, B). El uso de mayores volúmenes de solución precursora puede dar como resultado un hidrogel debajo del cubreobjetos base. Esto puede hacer que el cubreobjetos de la base se adhiera a la placa de Petri y se rompa al intentar retirarlo. Además, los residuos de hidrogel debajo del cubreobjetos son problemáticos para la microscopía. Se requiere una extracción suave del portaobjetos de vidrio perfluoroalquilado no reactivo, ya que una extracción rápida puede dañar el hidrogel.
   9. Coloque el sustrato en una placa de Petri de 60 mm x 15 mm en el medio de cultivo especificado. Aquí, se utilizaron medios ATGN suplementados con 100 μg/mL de espectinomicina para B. subtilis o 100 μg/mL de ampicilina para E. coli a 37 °C durante 24 h de tiempo de cultivo.

7. Preparación del material para la extracción celular

1. Preparación del soporte de PDMS (polidimetilsiloxano)
   1. Pegue con cinta adhesiva una pila de diez cubreobjetos de 18 x 18 mm y pegue esta pila de cubreobjetos en el fondo de una placa de Petri.
   2. Para fabricar soportes PDMS, mezcle el precursor PDMS y el agente de curado en una proporción de volumen de 10: 1 en un vaso de plástico, desgasifique la mezcla en un desecador al vacío y luego vierta la mezcla en la placa de Petri.
   3. Cure PDMS durante 90 min a 80 °C. Luego, corte alrededor del bloque con cinta adhesiva para quitar el soporte PDMS y coloque el soporte PDMS en un portaobjetos de vidrio para facilitar el manejo de la microscopía.
2. Preparación de microjeringas y tubos
   1. Corte 20 cm de tubo de PTFE (politetrafluoroetileno) (0,05 pulgadas de diámetro interior) y conecte un extremo del tubo a una jeringa de microlitros de 100 μl.
      NOTA: Para la extracción, evite el uso de pipetas, ya que extraer las células liberadas a través de una punta de pipeta puede dañar la superficie del hidrogel y provocar contaminación.

8. Degradación del hidrogel con la herramienta de iluminación estampada

1. Encienda el microscopio (consulte la Tabla de materiales). A continuación, active la herramienta de iluminación con patrón (consulte Tabla de materiales).
2. Encienda el módulo de control analógico y digital de la fuente de luz LED de 365 nm. A continuación, encienda el módulo de control de la fuente de luz LED.
3. Abra el software del microscopio y el software de la herramienta de iluminación con patrones. Cuando se abra la ventana de configuración de hardware, seleccione el botón Cargar.
   NOTA: Aquí se cargarán tres dispositivos. (Cámara de terceros, un módulo de control y la herramienta de iluminación con patrón)
4. Presione el botón Inicio. Ahora se abrirá la ventana del software de patrones de luz. Seleccione la primera opción, el botón Control de dispositivos, en la barra lateral izquierda de la ventana.
5. Calibre la herramienta de iluminación con patrón.
   NOTA: La calibración debe realizarse con el mismo objetivo y filtro del microscopio que se utilizará para la exposición a la luz.
   1. Ajuste el objetivo del microscopio a un aumento de 10x.
      NOTA: Este aumento permite suficiente distancia de trabajo entre la lente del microscopio y la superficie de la muestra. También permite monitorear y registrar el proceso de recuperación en tiempo real a través de la ventana de imagen.
   2. Ajuste la lente y el filtro del microscopio a la configuración utilizada para la exposición a la luz y coloque el espejo de calibración debajo del microscopio.
   3. En la ventana Control de dispositivos, presione la pestaña Control de LED. Encienda el LED #1 y ajuste la intensidad de la luz al número deseado. En los experimentos de extracción estándar, esto se establece en 60%.
   4. Presione la pestaña titulada con el nombre del producto de la herramienta de iluminación con patrón en la ventana Control de dispositivos. Luego, presione el botón Mostrar cuadrícula.
      NOTA: Se proyectará un patrón de cuadrícula en el espejo de calibración.
   5. Ajuste el enfoque del microscopio y la exposición de la cámara para obtener una alta calidad de imagen de la cuadrícula y gire la cámara para alinear las líneas de la cuadrícula paralelas al marco de la ventana de la cámara, si es necesario.
   6. Seleccione el botón Asistente de calibración debajo de la pestaña titulada con el nombre del producto de la herramienta de iluminación con patrón y siga las instrucciones proporcionadas por el software en esta ventana. NOTA: Se abrirá una ventana de configuración de cámara de terceros.
   7. Se abrirá una ventana de selección de tipo de calibración. Seleccione Calibración automática y pulse Siguiente.
   8. Cuando se abra la ventana Ajuste de precalibración, siga las instrucciones del software y presione el botón Siguiente.
   9. Cuando se abra la ventana Información de asignación, guarde esta calibración en consecuencia en la carpeta deseada. Esto se hace introduciendo la fecha, el nombre del microscopio, la lente del objetivo y el filtro.
   10. Después de la calibración, presione el botón Definición del área de trabajo que se encuentra debajo de la pestaña titulada con el nombre del producto de la herramienta de iluminación con patrón para definir el área de trabajo de la herramienta de iluminación con patrón si es necesario.
6. Sección de diseño de secuencias para la preparación de patrones.
   1. Presione el botón Diseño de secuencia en la barra lateral izquierda de la ventana del software. A continuación, pulse el botón Editor de secuencia de perfiles.
   2. Cuando se abra la ventana Editor de secuencia de perfiles, seleccione la opción Nuevo perfil en la Lista de perfiles.
      NOTA: Ahora, se abrirá una ventana del Editor de patrones.
   3. Prepare el patrón deseado para la exposición a la luz eligiendo diferentes formas y tamaños de patrón o dibujando manualmente el patrón, si lo desea.
   4. Para patrones circulares y cruzados discontinuos para el hidrogel a granel, siga los pasos 8.6.5 a 8.6.6
   5. Para los patrones circulares, defina un círculo con un diámetro de 30 μm sobre una colonia bacteriana objetivo para cubrir toda la colonia. Elige el color de relleno de la forma blanco.
   6. Para patrones de cruz discontinuos, elija la forma del rectángulo en la ventana de dibujo de patrones con dimensiones de 3 μm x 8 μm. Coloque cuatro rectángulos con estas dimensiones en los bordes de la colonia objetivo, mientras que la mitad de los patrones tienen una superposición con la colonia.
   7. Para los patrones de círculos y anillos para las matrices de micropocillos, siga los pasos 8.6.8-8.6.10.
   8. Para patrones circulares, dibuje un círculo de 10 μm de diámetro alrededor del perímetro del pozo. Elige el color de relleno de la forma blanco.
   9. Para el patrón de anillos, dibuje un círculo de 20 μm de diámetro, colóquelo sobre el pozo y elija el color de relleno de forma blanco.
   10. Dibuje otro patrón circular de 10 μm de diámetro con forma de relleno de color negro y colóquelo alrededor del perímetro del pozo.
7. Edite el patrón y modifique las formas según el método de extracción deseado. Asegúrese de que el patrón deseado exista dentro del área de trabajo de la herramienta de iluminación de patrón.
8. Coloque la muestra en un soporte PDMS y pipetee el medio definido en la parte superior de la muestra para evitar la deshidratación de la muestra y proporcionar una solución portadora para las células liberadas.
9. Luego, reemplácelo con el espejo de calibración.
10. Ajuste el enfoque del microscopio para obtener una imagen nítida de las colonias dentro del hidrogel. Inspeccione las colonias para identificar una colonia de interés.
11. Aquí, diseñe los patrones de luz mientras la vista de la cámara muestra las colonias dentro de la muestra para probar diferentes patrones para la extracción celular.
12. Guarde el patrón definido. Después de guardar el patrón definido, seleccione la sección Control de sesión.
13. En esta sección, en la pestaña titulada con el nombre del producto de la herramienta de iluminación con patrón, agregue la secuencia guardada.
14. Después de agregar la secuencia, elija la opción para simular el patrón para ver y ajustar la ubicación deseada de exposición.
    NOTA: La ubicación de la muestra se puede ajustar aquí para garantizar que el patrón se proyecte con precisión en el área objetivo.
15. A continuación, ajuste la intensidad de la luz al 60% y el tiempo de exposición a 40 s en la pestaña de control LED e inicie el proceso de exposición.
16. Supervise la degradación del hidrogel en tiempo real y en modo de campo claro para garantizar la liberación de la celda.
    NOTA: Evite cualquier movimiento en la muestra durante la exposición a la luz, ya que puede causar la degradación de áreas no deseadas del hidrogel que resultan en contaminación cruzada.

9. Recuperación de células

1. Después de la exposición a la luz de 365 nm y la liberación de células, las células se recolectan con una jeringa de microlitros y un tubo microfluídico (Figura 2).
   NOTA: La recuperación celular debe realizarse inmediatamente después de la exposición al patrón. Esto permite la recuperación celular localizada antes de que las células liberadas se alejen del área irradiada.
2. Cambie el microscopio de campo claro a filtro FITC o TRITC para permitir visualizar el área expuesta de la muestra a simple vista.
3. Una vez localizada la zona expuesta, coloque el extremo del tubo sobre el punto irradiado. Luego, cambie el filtro del microscopio nuevamente a campo claro para monitorear la recuperación celular en tiempo real.
4. Use la jeringa conectada al otro extremo del tubo para extraer con cuidado las células liberadas. Extraer 200 μl de la solución e insertarla en un tubo de centrífuga de 1,5 ml para el análisis de ADN o el recubrimiento.

Results

Figura 1: Formación de hidrogel en cubreobjetos de vidrio tiolado. (A) Los espaciadores con un espesor de 12,7 μm se colocan en dos lados opuestos de un cubreobjetos base que contiene grupos tiol reactivos. (B) La solución precursora de hidr...

Materials