Cuantificación del alginato bacteriano mediante el ensayo de carbazol con ácido urónico

Resumen

Fuente: Al Ahmar, R., et al. Cultivo de la variante de colonias pequeñas de Pseudomonas aeruginosa y cuantificación de su alginato. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra un ensayo colorimétrico para cuantificar el alginato producido por Pseudomonas aeruginosa, utilizando carbazol para detectar ácidos urónicos después de la hidrólisis ácida. El método permite el análisis comparativo de la producción de alginato normalizada a la biomasa bacteriana en investigación y estudios clínicos.

Protocolo

1. Ensayo de carbazol con ácido urónico

1. Identifique una sola colonia a partir de un cultivo puro de la cepa deseada para ser analizada. Con un palillo estéril, recoja la colonia y coloque el palillo en un tubo de ensayo de cultivo que contenga 5 ml de caldo de aislamiento de Pseudomonas (PIB). Cultivar en una incubadora agitadora a 37 °C durante 24 h.
   NOTA: Las siguientes cepas, PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB y PAO581pyrD, se cultivaron en placas PIA (agar de aislamiento de Pseudomonas ) o placas PIA complementadas con uracilo 0,1 mM para cosechar alginato para la medición.
2. En una placa PIA precalentada, agregue 150 μL de caldo PIB cultivado (para placas de 15 mm x 100 mm) o 450 μL de caldo (para placas de 15 mm x 150 mm). Con un esparcidor de células estériles, extienda el caldo sobre el plato. Hacer crecer la placa a 37 °C durante 24 h.
   NOTA: Aspire cualquier exceso de líquido, si lo hubiera, de la placa con una pipeta inclinando la placa hacia un lado. Tanto las placas PIB como PIA utilizadas en el protocolo contienen 20 ml / L de glicerol, que las células utilizan como fuente de carbono para ayudar en la producción de alginato.
3. Con un controlador de pipetas y una pipeta estéril de 50 ml, agregue NaCl (cloruro de sodio) al 0,85 % al césped cultivado y recolecte la muestra raspando la placa con un esparcidor de células. Aspire la muestra con una pipeta nueva de 50 ml en un tubo de recolección de 50 ml. Agite la muestra a temperatura alta para mezclar y colocar las muestras en hielo.
   NOTA: El volumen de NaCl al 0,85% añadido varía según el tamaño de la placa. Para placas de 15 mm x 100 mm, use 10-30 ml, y para placas de 15 mm x 150 mm, use 20-50 ml.
4. Mida la densidad óptica a 600 nm (DE₆₀₀) de las muestras agregando 1 ml de la muestra a una cubeta desechable y leyendo el DO con un espectrofotómetro. Repita este paso 2 veces para obtener un triplicado de lecturas para cada muestra.
5. Agregue 3 ml de la solución de ácido sulfúrico / borato a los tubos de cultivo y déjelo reposar sobre hielo. Agregue 350 μL de la muestra recolectada lentamente a la mezcla ácida en los tubos de ensayo y vórtice a baja temperatura brevemente.
   1. Prepare el caldo de borato agregando 10.099 g de hidróxido de potasio (KOH) en polvo a 45 ml de agua. Agregue 24,74 g de ácido bórico (H₃BO₃) a la mezcla y lleve el volumen a 100 ml.
   2. Coloque una botella de 1 L en un fregadero con hielo y llénela con 500 ml de ácido sulfúrico concentrado. Agregue LENTAMENTE 15 ml del caldo de borato preparado. Deje que la botella se enfríe.
   3. Agregue otros 10 ml de caldo de borato para un total de 25 ml. Una vez que la botella se haya enfriado, lleve el volumen a 1 L.
      CAUTELA: Este método se basa en el uso de ácido sulfúrico altamente concentrado. Se debe usar el equipo de protección personal adecuado para garantizar la seguridad y se debe seguir el protocolo de eliminación adecuado para la muestra.
      NOTA: Para un control positivo, se recolecta y purifica una concentración conocida de ácido D-manurónico y/o una muestra conocida de alginato bacteriano a través de cepas productoras de alginato de P. aeruginosa (p. ej., PAO581-PAO1mucA25). Para un control negativo, use una solución de NaCl al 0,85% y/oPAO1Δ algD (deleción en el marco del gen algD que hace que las bacterias sean completamente incapaces de producir alginato). Se pueden hacer múltiples tubos a partir de cada muestra para aumentar el número de repeticiones técnicas para ayudar en el análisis estadístico. Prepare de 3 a 5 tubos de cada muestra.
6. Agregue 100 μL de carbazol al 0,1% en solución de etanol a la mezcla de ácido / muestra. Tape el tubo y el vórtice en configuración media durante 5 s. Colocar en un baño seco a 55 °C durante 30 min.
7. Después de la incubación, retire los tubos y el vórtice brevemente a temperatura alta y deje enfriar durante 5 min.
   NOTA: El color que se vería sería un tono de púrpura. El color permanecerá estable para la medición durante 1−2 h.
8. Lea el OD₅₃₀ de cada tubo agregando 1 ml de la mezcla a una cubeta limpia y leyendo el OD de las muestras a 530 nm en un espectrofotómetro. Utilice el tubo con NaCl al 0,85% como blanco en el espectrofotómetro.
9. Prepare una curva estándar midiendo el DO₅₃₀ de diluciones en serie de concentraciones conocidas de ácido D-manurónico (1.024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml y 8 μg/ml). Repite 2 veces. Extrae una ecuación lineal de estas lecturas.
   NOTA: La curva estándar solo debe hacerse una vez. La ecuación lineal extraída de ella se puede utilizar para pruebas posteriores.
   1. Calcule la concentración de alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y divida la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD₆₀₀ para obtener la cantidad total de alginato por OD₆₀₀.

Materiales