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1. ELISA para la cuantificación de alginato
1. Con una micropipeta, agregue 50 μL de la muestra recolectada a una placa de 96 pocillos sin tratar. Agregue 50 μL de tampón de recubrimiento (tampón de carbonato/bicarbonato pH 9,6) a los pocillos. Incubar la placa a 37 °C durante 2 h.
NOTA: Para un control positivo, se puede utilizar una concentración conocida de ácido D-manurónico y/o una cepa productora de alginato estable conocida (por ejemplo, PAO581- PAO1mucA25). Para un control negativo, use una solución de NaCl al 0,85% y / oPAO1Δ algD (la deleción en el marco del gen algD hace que las bacterias sean completamente incapaces de producir alginato). Se pueden hacer múltiples pozos a partir de cada muestra para aumentar el número de repeticiones técnicas para ayudar en el análisis estadístico. Prepare de 3 a 5 pocillos de cada muestra.
2. Con una botella con atomizador, lave los pocillos de la placa 2 veces con 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,05% Tween 20 (PBS-T) llenando los pocillos y luego drenándolos volteando la placa.
3. Con una micropipeta, agregue 200 μL de tampón de bloqueo (leche desnatada al 10% en PBS-T) a los pocillos. Incubar a 4 °C durante la noche.
NOTA: Envuelva el plato en una película de parafina o una envoltura retráctil para ayudar a evitar la evaporación en el refrigerador.
4. Con una botella con atomizador, lave los pocillos de la placa 2 veces con PBS-T llenando los pocillos y luego drenándolos volteando la placa.
5. Con una micropipeta, agregue 100 μL de anticuerpo primario diluido (anticuerpo monoclonal antialginato de ratón) a los pocillos e incube a 37 ° C durante 1-2 h.
NOTA: El anticuerpo primario (anticuerpo monoclonal antialginato de ratón) se administró a una concentración de 0,5 μg/ml (dilución de 1:2.000 de 1 mg/ml de caldo) en solución diluyente de anticuerpos (leche desnatada al 1% en 1x PBS).
6. Con una botella con atomizador, lave los pocillos de la placa 3 veces con PBS-T llenando los pocillos y luego drenándolos volteando la placa.
7. Con una micropipeta, agregue 100 μL de anticuerpo secundario diluido a los pocillos e incube a 37 ° C durante 1-2 h.
NOTA: El anticuerpo secundario utilizado fue el anticuerpo peroxidasa poli-rábano picante (HRP) anti-cabra perforada a una concentración de 0,25 μg/ml (dilución de 1:2.000 de 0,5 mg/ml) en solución diluyente de anticuerpos.
8. Con una botella con atomizador, lave los pocillos de la placa 3 veces con PBS-T llenando los pocillos y luego drenándolos volteando la placa.
9. Con una micropipeta, agregue 100 μL de solución TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina)-ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) (tabla de materiales) e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.
NOTA: El color de una reacción positiva sería un tono de azul.
10. Con una micropipeta, agregue 100 μL de solución de parada (ácido sulfúrico 2 N).
NOTA: El color cambiará de azul a amarillo cuando se agregue la solución de parada. El color es estable hasta 30 minutos después de detener la reacción.
11. Con un lector de placas, lea el diámetro exterior a 450 nm.
12. Produzca una curva estándar midiendo el DO450 de diluciones en serie de concentraciones conocidas de ácido D-manurónico (1,024 μg / mL, 512 μg / mL, 256 μg / mL, 128 μg / mL, 64 μg / mL, 32 μg / mL, 16 μg / mL y 8 μg / mL). Repite 2 veces. A partir de estas lecturas, extrae una ecuación lineal.
NOTA: La curva estándar debe realizarse solo una vez. La ecuación lineal extraída de ella se puede utilizar para pruebas posteriores.
1. Calcule la concentración de alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y divida la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600.