Modelado de la colonización vaginal murina por bacterias anaeróbicas

Resumen

Fuente: Morrill, S. R., et al. Modelos de colonización vaginal murina por bacterias cultivadas anaeróbicamente. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra un protocolo para modelar la colonización vaginal en ratones utilizando bacterias anaeróbicas resistentes a los antibióticos. Comienza con un tratamiento hormonal para aumentar la susceptibilidad epitelial, seguido de la inoculación vaginal y la co-inoculación en condiciones anaeróbicas. El procedimiento concluye con un muestreo y cultivo posterior a la inoculación para evaluar la colonización bacteriana y la formación de biopelículas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Preparación del inóculo

NOTA: Esta sección contiene los pasos generales para la preparación de inóculos a partir de Gardnerella vaginalis resistente a la estreptomicina cultivada anaeróbicamente JCP8151B-SmR. Todos los pasos de esta sección deben realizarse en una cámara anaeróbica.

1. Cicle cualquier reactivo, incluido el caldo III preparado de la ciudad de Nueva York (NYCIII), el agar y la solución salina tamponada con fosfato (PBS), en una cámara anaeróbica para equilibrar durante al menos 24 h antes de su uso.
   NOTA: Aquí, se utilizó una cámara anaeróbica de vinilo equilibrada con una mezcla de gas hidrógeno al 5%. La concentración interna de oxígeno generalmente se mantiene en 0 ppm, aunque puede haber aumentos transitorios de bajo nivel (10-25 ppm) cuando los materiales ingresan a la cámara.
2. Dos días antes de la inoculación vaginal, elimine Gardnerella de un stock de glicerol congelado en una placa de agar NYC III en la cámara anaeróbica. Utilice un recipiente pequeño (como una caja de puntas de pipeta vacía) lleno de hielo seco para mantener congelado el stock de glicerol durante el transporte dentro y fuera de la cámara.
3. 1 día antes de la inoculación vaginal, use de 5 a 10 colonias individuales de Gardnerella de la placa para inocular 10 ml de caldo NYC III. Deje que el cultivo líquido crezca durante la noche durante 16 h a 37 °C. Incluya una segunda alícuota de 1 ml del medio de cultivo que se deja sin inocular e incube junto con el cultivo inoculado para confirmar que el medio no está contaminado.
4. Prepare el inóculo a partir de cultivo líquido como se describe a continuación. Realice la preparación del inóculo en la cámara anaeróbica tanto como sea posible.
   1. Determine la densidad óptica (DO) del cultivo agregando 200 μL de cultivo a 800 μL de medios frescos en una cubeta de 1,5 ml (dilución 1:5). Utilice un espectrofotómetro para medir la densidad (OD) del cultivo diluido a una longitud de onda de 600 nm (utilice una cubeta separada con medios nuevos solo como blanco). Multiplique la lectura de OD por 5 para obtener el OD₆₀₀ real de la referencia cultural de 16 h.
   2. Calcule el volumen de inóculo necesario para el experimento. Por ejemplo, para infectar a 15 ratones con un inóculo de 20 μL por ratón, se necesitan 15 x 20 μL = 300 μL de inóculo. Prepare aproximadamente un 25% más de inóculo del necesario, por lo que para 15 ratones, prepare 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL de inóculo.
   3. Utilizando el OD₆₀₀ determinado en el paso 1.4.1, calcule el volumen del cultivo de 16 h que debe centrifugarse y resuspenderse para obtener un inóculo OD₆₀₀ = 5,0 en el volumen calculado en el paso 1.4.2. Por ejemplo, si el OD₆₀₀ del cultivo es 1,5 y el volumen de inóculo necesario es de 375 μL, entonces el volumen de cultivo a centrifugar es (375 μL x 5) / 1,5 = 1250 μL.
   4. Pipetear el volumen de cultivo calculado en el paso 1.4.3. en un tubo de microcentrífuga estéril. Granular las bacterias centrifugando a 16.000 x g durante 1-3 min.
   5. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en PBS anaeróbico al volumen calculado en el paso 1.4.2. El inóculo ahora estará en un OD₆₀₀ calculado de 5.0. Si corresponde, también prepare un tubo de PBS para que sirva como control del vehículo para ratones en el grupo de control no infectado.
5. Antes de retirar el tubo de inóculo de la cámara anaeróbica, prepare una serie de diluciones en serie de 1:10 a 1:10 x 10⁶ en PBS. Spotspot placa 5 réplicas de cada dilución en una placa de agar utilizando una pipeta multicanal para determinar las unidades formadoras de colonias o UFC del inóculo. Esta es la UFC previa a la inoculación.
6. Prelavado vaginal e inoculación con Gardnerella
   1. Prepare tubos de lavado vaginal en la cámara anaeróbica. Pipetee 70 μL de PBS anaeróbico estéril en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml marcados con números de ratón. Prepare un tubo de lavado por ratón. Cierre bien los tubos y sáquelos de la cámara anaeróbica.
   2. Realice un lavado vaginal en cada ratón con 50 μL de PBS anaeróbico de las trompas individuales preparadas en el paso 2.1. Estos lavados vaginales son los lavados previos a la inoculación y se pueden utilizar para mediciones y ensayos posteriores.
      1. Después de la administración de la segunda inyección de valerato de β-estradiol, coloque cada ratón encima de una jaula o una superficie limpia y dura que pueda agarrar con sus patas delanteras. Sujete suavemente la parte media de la cola y levántela para que los cuartos traseros estén ligeramente elevados y la abertura vaginal quede expuesta.
      2. Con una pipeta y una punta de filtro p-200, extraiga 50 μL de PBS del tubo de lavado correspondiente al ratón correspondiente. Inserte suavemente la punta de la pipeta en la luz vaginal ~2-3 mm, y pipetee el volumen de 50 μL hacia adentro y hacia afuera suavemente, 3x-4x.
      3. Transfiera el material de lavado recolectado (~ 50 μL) nuevamente al mismo tubo de lavado del que proviene, pipeteando hacia arriba y hacia abajo en el tubo de lavado que aún contiene los 20 μL restantes de PBS. Si hay un exceso de moco y la punta se obstruye, use una punta p200 limpia para recoger el material restante y colóquelo en el mismo tubo de lavado.
   3. Administre por vía vaginal 20 μL de la suspensión bacteriana concentrada o control del vehículo en la vagina de cada ratón. Inocule a cada ratón inmediatamente después del lavado vaginal para ese ratón (es decir, realice el lavado y la inoculación en secuencia para cada ratón antes de pasar al siguiente). Para simplificar este proceso, utilice dos pipetas p200, una ajustada a 50 μl para lavados y la otra a 20 μl para inoculaciones.
      1. Sujete el mouse como se describe en el paso 2.2.1. Con una punta p-200, pipetee 20 μL de suspensión bacteriana en la vagina. Para experimentos de coinoculación con dos especies/cepas bacterianas diferentes, use 10 μL de cada suspensión bacteriana y evite mezclar las dos cepas antes de la inoculación.
         NOTA: El volumen total de inoculación no debe exceder los 20 μL para evitar el desbordamiento fuera de la vagina.
      2. Continúe sosteniendo la parte trasera de cada ratón durante 10-20 s para evitar que el volumen administrado se acumule inmediatamente en el introito vaginal. Luego, coloque al ratón en una nueva jaula / receptáculo o con compañeros de jaula que ya hayan sido inoculados.
      3. Repita el paso 2.2. y paso 2.3. para cada ratón. Nunca vuelva a colocar ratones en una jaula con animales que aún no hayan sido inoculados. Esto evita la exposición inadvertida de ratones a bacterias resistentes a la estreptomicina antes de la inoculación.
   4. Después de que todos los ratones hayan sido inoculados, vuelva a colocar el tubo de inóculo en la cámara anaeróbica. Prepare y coloque en placa otra dilución en serie como se describe en el paso 1.5. Esta es la UFC posterior a la inoculación. Compare las UFC de las placas posteriores y previas a la inoculación para determinar si la viabilidad del inóculo disminuyó mientras estaba fuera de la cámara anaeróbica durante la inoculación de los animales.
   5. Coloque en una placa los lavados vaginales recogidos en el paso 2.2. en agar selectivo (en este caso, 1 mg/ml de estreptomicina). Incube las placas durante 1-2 días en una cámara anaeróbica a 37 °C y examine el crecimiento. NOTA: El crecimiento indica que los miembros endógenos del microbioma son resistentes al marcador de selección y, por lo tanto, pueden oscurecer la enumeración de UFC del organismo objetivo.
7. Recolección de lavados vaginales para determinar la colonización viable de Gardnerella
   1. Recoja los lavados vaginales en puntos de tiempo seleccionados para analizar la colonización vaginal. Recopile como se describe en el paso 2.2.
   2. Inmediatamente después de la recolección, cicle los lavados vaginales en una cámara anaeróbica. Utilice 10 μl de cada lavado para realizar la dilución en serie y el recubrimiento en agar selectivo como se describe en el paso 1.5. Utilice los recuentos de UFC como una medida de la colonización vaginal por Gardnerella (u otro anaerobio de interés).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
β-estradiol 17-valerato	Sigma	E1631	Estrogenización de ratones
1x PBS	Pescador	MT21040CM	lavado vaginal, preparación del inóculo de G. vaginlalis , recolección y homogeneización de tejidos
Cámara anaeróbica	Tímido	7200000	Crecimiento de bacterias anaeróbicas
Bacto agar	Pescador	DF0140074	Placas de agar G. vaginalis, F. nucleatum y P. bivia
Glucosa	Sigma	G7528	NYCIII media para el crecimiento de G. vaginalis
HEPES	Cellgro	25-060-CL	NYCIII media para el crecimiento de G. vaginalis
Suero de caballo	Hemostático	SHS500	NYCIII media para el crecimiento de G. vaginalis
Mezcla de gas hidrógeno (5% hidrógeno, 10% CO₂, 85% nitrógeno)	Matheson		Gas para cámara anaeróbica
Purificador de agua Milli-Q	Millipore	IQ-7000	para la fabricación de medios y homogeneización
NaCl	Sigma	S3014	NYCIII media para el crecimiento de G. vaginalis
Gas nitrógeno	Airgas		Gas para cámara anaeróbica
Puntas de filtro P-200	Biografía de ISC	P-1237-200	Lavados vaginales e inoculaciones bacterianas
Aceite de sésamo	Pescador	ICN15662191	Estrogenización de ratones
Espectrofotómetro	BioCromo	80-3000-45	medición de la OD₆₀₀ bacteriana
Estreptomicina	Gibco	11860038	Añadir al medio de agar para hacer placas selectivas
Extracto de levadura	Pescador	DF0127-17-9	NYCIII media para el crecimiento de G. vaginalis