Ensayo de inundación de plántulas para detectar la resistencia bacteriana en tomates

Resumen

Fuente: Hassan, J. A., et al. Identificación de alto rendimiento de resistencia a Pseudomonas syringae pv. Tomate en tomate usando el ensayo de inundación de plántulas. J. Vis. Exp. (2020).

Este video demuestra un método para detectar resistencia bacteriana en diferentes cepas de tomate utilizando plántulas de diez días inoculadas con una suspensión bacteriana. Explica cómo las bacterias invaden a través de los estomas, entregan proteínas efectoras para suprimir la inmunidad de las plantas y cómo las respuestas de las plantas difieren entre cepas susceptibles y resistentes. El resultado se evalúa observando diferencias visibles de crecimiento, con plantas resistentes que permanecen sanas y susceptibles que muestran daño tisular.

Protocolo

1. Método de inundación de plántulas de tomate

1. Saque las placas con las plántulas de 10 días de la cámara de crecimiento y colóquelas en el gabinete de bioseguridad para preparar las placas para la inundación.
2. Retire la cinta quirúrgica de dos placas.
3. Configure un temporizador de 3 minutos. Mida 6 ml del inóculo final de P. syringae pv. tomate (Pst) (Pst19 OD₆₀₀ = 0.0075 o PstDC3000 OD₆₀₀ = 0.005) y transferir 6 mL de inóculo a cada placa con las plántulas de 10 días de edad.
4. Empuje suavemente las plántulas hacia abajo en el inóculo con una punta de pipeta estéril. Inicie el temporizador.
5. Sostenga un plato en cada mano. Incline el frente de la placa hacia abajo para acumular inóculo y sumergir principalmente los cotiledones y las hojas de las plántulas.
6. Agite de lado a lado de 5 a 7 veces y luego incline las placas hacia atrás para cubrir las raíces y toda la placa.
7. Inclina las placas hacia abajo nuevamente para sumergir los cotiledones y las hojas, y repite durante un total de 3 min.
8. Vierta el inóculo de las placas, colóquelas sobre una superficie plana y luego vierta cualquier inóculo residual por segunda vez.
9. Vuelva a envolver las placas con cinta quirúrgica y repita los pasos 1.2 a 1.8 para las placas restantes.
10. Vuelva a incubar las placas en la cámara de crecimiento después de que todas las placas se hayan inundado.

Fenotipo después de 7-10 días para PstDC3000 o 10-14 días para Pst19.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cabina de bioseguridad, clase II tipo A2
MARCA Cubetas de plástico desechables, poliestireno	VWR Internacional	47744-642
Palillos de madera plana Chenille Kraft	VWR Internacional	500029-808
Mecha de vidrio para quemador de alcohol	Fisher Scientific	S41898A / No. W-125
Quemadores de alcohol de vidrio	Fisher Scientific	S41898 / No. BO125
Reactivo de glicerol ACS	VWR Internacional	EMGX0185-5
Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Limpiadores de tareas delicadas	Fisher Scientific	06-666-A
Cloruro de magnesio, grado ACS	VWR Internacional	97061-356
Sulfato de magnesio heptahidratado, grado ACS	VWR Internacional	97062-130
Tubos de microcentrífuga, 1,5 ml
Tubos de microcentrífuga, 2,2 ml
Murashige & Skoog, Sales basales	Laboratorios Caisson, Inc.	MSP01-50LT
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL	Rainin	L8-200XLS
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL	Rainin	L8-20XLS
Placa de Petri estéril de poliestireno de 100 mm x 25 mm	VWR Internacional	89107-632
Placa de Petri estéril de poliestireno de 150 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB08-757-14
Placa de Petri estéril de poliestireno 150x15mm	Fisher Scientific	08-757-148
Puntas LTS 20 μL 960/10 GPS-L10	Rainin	17005091
Puntas LTS 250 μL 960/10 GPS-L250	Rainin	17005093