Suministro localizado de bacterias en la luz intestinal de una larva de pez cebra mediante microinyección

Resumen

Fuente: Li, J. et al. Desarrollo de un modelo de infección por larvas de pez cebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la administración basada en microinyección de Clostridioides difficile marcado con fluorescencia en la luz intestinal de una larva de pez cebra anestesiada. Describe los pasos involucrados en la preparación de larvas, la inyección bacteriana y la confirmación basada en microscopía de fluorescencia de la localización bacteriana dentro del intestino.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité de cuidado animal institucional local y la junta de revisión veterinaria JoVE.

1. Inyección de Clostridioides difficile teñido en larvas de pez cebra

1. Anestesiar 20-30 larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización (denominado aquí 5 dpf) con tricaína al 0,02%-0,04% (el polvo de tricaína se disuelve en agua doblemente destilada y se ajusta a pH = 7 con una solución de Tris-HCL 1 M) en medio de Danieau al 30% ~ 10 min antes de la inyección. Transfiera las larvas anestesiadas a una placa de Petri fresca de 10 cm y elimine el exceso de medio de Danieau al 30%.
2. Coloque una gota de agarosa de bajo derretimiento al 0,8% sobre las larvas de pez cebra para cubrirlas. Ajuste suavemente las larvas a una posición lateral. Coloque la placa de Petri en hielo durante 30-60 s para permitir que la agarosa de bajo punto de fusión se solidifique. Agregue un 30% de medio de Danieau que contenga 0.02% a 0.04% de tricaína para cubrir la agarosa.
3. Prepare la solución inyectable. Agregue 1 μl de rojo de fenol al 0,5% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en 9 μl del inóculo de Clostridioides difficile teñido con colorante para visualizar el proceso de inyección.
4. Cargue una aguja de microinyección calibrada con la solución de inyección usando un microcargador. Monte la aguja cargada en un micromanipulador y colóquela debajo de un microscopio estereoscópico.
5. Ajuste la presión de inyección entre 600 y 900 hPa. Ajuste el tiempo de inyección a 0,1-0,3 s para obtener 0,5-1,0 nL. Coloque la aguja en el micromanipulador en un ángulo de ~ 45 ° apuntando hacia las larvas incrustadas.
6. Coloque la punta de la aguja por encima del tracto gastrointestinal, cerca del poro urogenital. Perfore a través de la agarosa, luego el músculo con la punta de la aguja, luego insértelo en la luz intestinal e inyecte 0.5-1.0 nL de Clostridioides difficile. Use un microscopio de fluorescencia para monitorear las larvas inyectadas y recoger las larvas inyectadas correctamente para obtener imágenes confocales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa de bajo punto de fusión (LM)	Pronadisa	8050	Se utiliza en placas de agarosa
Tinción bacteriana roja BacLight	Thermo Fisher Scientific	B35001	Tinte fluorescente
Vidrio capilar	Aparato de Harvard	30-0019	Agujas de inyección
Clostridioides difficile			R20291, una cepa de ribotipo 027, producción de TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	Plataforma de código abierto		Tratamiento de imágenes
Micro inyector	eppendorf	5253000017
Microscopio confocal Leica SP8	Leica
Rojo de fenol	Sigma-Aldrich	P0290
Tricaína	Sigma-Aldrich	E10521