Aislamiento y cultivo de bacterias Clostridioides difficile a partir de larvas de intestino de pez cebra

Resumen

Fuente: Li, J., et. al., Desarrollo de un modelo de infección de larvas de pez cebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra el aislamiento y cultivo de la bacteria Clostridioides difficile del intestino de las larvas de pez cebra. El intestino infectado se disecciona, homogeneiza e incuba en medios anaeróbicos selectivos que contienen antibióticos. Estas condiciones suprimen los microbios competidores y promueven el crecimiento de células viables.

Protocolo

Disección de larvas de intestino de pez cebra para recuperar Clostridioides difficile viable

1. Aísle los tractos gastrointestinales de las larvas para analizar la carga bacteriana. Comience por sacrificar las larvas de pez cebra con 0,4 % de tricaína.
2. Enjuague brevemente el pez cebra con 1x PBS estéril (solución salina tamponada con fosfato) y transfiéralos a una placa de agarosa fresca.
3. Disección del pez cebra
   1. Inserte una aguja en el tronco dorsal de las larvas de pez cebra cerca de la cabeza para inmovilizar al pez cebra. Retire la cabeza detrás de las branquias con una lanceta.
   2. Inserte la segunda aguja en el medio del tronco dorsal. Inserte la tercera aguja en el abdomen del pez cebra y saque el intestino de la cavidad corporal.
      NOTA: Se necesita mucho cuidado para aislar el intestino intacto. Si es difícil hacerlo, realice tirones adicionales para separar el resto del intestino de los órganos internos restantes.
   3. Use una aguja de microinyección para transferir de 10 a 15 intestinos a un tubo de 1,5 ml que contiene 200 μl estériles 1x PBS.
   4. Homogeneizar los intestinos con un mortero para alterar el tejido y preparar homogeneizados. Asegúrese de que el mortero llegue al fondo del tubo para romper completamente todos los intestinos.
4. Incubar los homogeneizados en un medio de cría de C. difficile que contenga D-cicloserina y cefoxitina, con o sin taurocolato (TCA, un germinante de las esporas de C. difficile ) en una cámara anaeróbica.
5. Incubar la placa anaeróbicamente durante 48 h a 37 °C.

Materiales