Reactivación y crecimiento de bacterias lácticas

Resumen

Fuente: Ayivi, R. et al., El cultivo, el crecimiento y la viabilidad de las bacterias del ácido láctico: una perspectiva de control de calidad. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra el método para recuperar bacterias de ácido láctico sometidas a estrés frío de un stock de glicerol congelado, restaurar la viabilidad bacteriana a través de la incubación anaeróbica y aislar colonias activas para la expansión del cultivo.

Protocolo

1. Protocolo para la activación y control de calidad de cultivos de bacterias lácticas (BAL)

1. Tome el stock de glicerol preparado de cepas LAB (en tubos de centrífuga de 2 ml) del congelador ultra bajo a -80 °C y no permita que se descongelen antes de su uso.
2. Limpie y desinfecte la abertura de los tubos de la centrífuga con alcohol al 70% y haga un vórtice suave antes de usarlo.
3. Pipetee aproximadamente 250 μL (0,25 ml) del cultivo LAB de los tubos de centrífuga en tubos de ensayo MRS (medios deMan, Rogosa y Sharpe) nuevos de 2 ml.
4. Agite suavemente, parafilme los tubos de ensayo e incube anaeróbicamente durante la noche a 42 ° C durante 12-16 h.
5. Tome aproximadamente 500 μL (0,5 mL) de los cultivos cultivados durante la noche de los tubos de ensayo MRS de 2 mL en tubos de ensayo MRS frescos de 7 mL, vórtice e incube anaeróbicamente durante la noche a 42 ° C durante 12-16 h.
6. Evaluar el crecimiento microbiano midiendo la densidad óptica (DO) o el crecimiento de los cultivos a 610 nm con un espectrofotómetro UV-visible y registrando resultados aceptables entre 0,7 y 0,9.
7. Estreche los cultivos nocturnos de los tubos MRS de 7 ml en placas de agar MRS y MRCM-PYR (piruvato medio clostridial reforzado modificado) e incube anaeróbicamente durante 72 h a 42 °C.
8. Las colonias aisladas se recogen de las placas de agar, se transfieren a tubos de ensayo MRS frescos de 7 ml, se agitan suavemente en vórtices y se incuban anaeróbicamente durante la noche a 42 °C durante 12-16 h.
9. Conservar en el frigorífico las placas de agar que contienen las cepas aisladas a 4 °C durante una semana.
10. Mida y confirme la OD (entre 0,7 y 0,9) de los tubos de ensayo MRS de 7 ml de los cultivos LAB aislados de las placas rayadas a 610 nm y utilícelos como cultivos de trabajo para todos los experimentos relacionados.
11. Para obtener una proporción de 1:10, realice diluciones diez veces (diluciones en serie) de los cultivos LAB cultivados de los tubos de ensayo MRS finales de 7 ml utilizando 9 ml de agua de peptona (un tampón fisiológico).
12. Finalmente, tome aproximadamente 250 μL (0,25 mL) de diluciones en serie apropiadas para todos los experimentos de fermentación.
13. Active las cepas que contienen caldo (250 μL) a partir del paso 2.12 transfiriéndolas a caldo MRS fresco de 7 ml e incubándolas anaeróbicamente a 42 °C durante 16 h.
    NOTA: Todas las cepas de L. bulgaricus se activaron en el caldo MRS recién preparado y luego se incubaron anaeróbicamente a 42 °C durante 16 h para alcanzar una densidad óptica (OD₆₁₀ nm) de crecimiento bacteriano entre 0,7 y 0,9. El crecimiento bacteriano se midió con un espectrofotómetro UV-visible a 610 nm. Los valores de pH de los cultivos nocturnos estuvieron en el rango de 3,5 a 5,3 como resultado de la producción de ácido láctico, un producto final orgánico de la fermentación BAL. Se cumplieron y observaron procedimientos de seguridad como la circulación adecuada del flujo de aire en la campana de bioseguridad y evitar quemaduras durante el uso del mechero Bunsen.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Azul anilina	Thermo Scientific	Referencia R21526	25 gramos
Extracto de carne de res	Investigación Productos Internacional	50-197-7509	500 gramos
Extracto de levadura	Fisher Scientific	BP1422-500	500 gramos
Cloruro de calcio dihidrato	Fisher Scientific	C79-500	500 gramos
Dextrosa anhidra	Fisher Scientific	BP350500	500 gramos
D-fructosa	ACROS Organics	AC161355000	500 gramos
Polvo de agar Difco	Difco	DF0812-07-1	2 kg
Agar TPY	Difco	211921	500 gramos
Tubo de microcentrífuga Eppendorf (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 ml
Glicerol	Thermo Scientific	PI17904	500 ml
Incubadora de CO₂ por infrarrojos	Forma Científica
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Colección de cultivos de tipo americano (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Laboratorio de Microbiología y Biotecnología de Alimentos (NCATSU)	GRAJILLA
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Laboratorio de Microbiología y Biotecnología de Alimentos (NCATSU)	E22
Lactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Laboratorio de Microbiología y Biotecnología de Alimentos (NCATSU)	RD2
Clorhidrato de L-cisteína monohidrato	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 gramos
Maltosa monohidrato	Fisher Scientific	M75-100	100 gramos
Caldo MRS	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptona n.º 3	Hach	50-199-6719	500 gramos
Fosfato de potasio dibásico (K₂HPO₄)	Investigación Productos Internacional	50-712-761	500 gramos
Acetato de sodio trihidrato	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Piruvato de sodio	Fisher Scientific	BP356-100	100 gramos
Tubos de ensayo con tapones de rosca revestidos de goma	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Interpolación 80	Fisher Scientific	T164-500	500 ml
Congelador ultra bajo	Tan bajo
Uracilo	ACROS Organics	AC157301000	100 gramos
Espectrofotómetro UV-visible	Thermo Fisher Scientific	Evolución 201
Genio del vórtice 2	Fisher Scientific
Extracto de levadura	Fisher Scientific	BP1422-500	500 gramos
Etanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Ácido clorhídrico (6N (certificado), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 ml