Precipitación de calcita inducida microbiológicamente por Sporosarcina pasteurii

Resumen

Fuente: Bhaduri, S., et al., Precipitación de calcita inducida microbiológicamente mediada por Sporosarcina pasteurii. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra el método de enriquecimiento de Sporosarcina pasteurii con urea y cloruro de calcio para desencadenar la actividad de la ureasa, lo que lleva a la formación de cristales de calcita visibles a través de la precipitación de calcita inducida microbiológicamente o MICP.

Protocolo

1. Protocolo de enriquecimiento de nutrientes para acelerar la precipitación

1. Transfiera 9 ml del líquido de cultivo preparado (células + medio) a varios tubos de centrífuga esterilizados, cada uno de 10 ml de volumen.
2. Preparar una solución madre de 100 ml del enriquecimiento externo que consta de cuatro componentes en las siguientes concentraciones en medio fresco: Urea: 2 g/L, Cloruro de amonio: 1 g/L, Bicarbonato de sodio: 212 mg/L, Cloruro de calcio: 280 mg/L. Medir cuidadosamente todos los ingredientes utilizando una balanza analítica y mezclar todos menos la urea con el medio fresco en un vaso de precipitados y colocar en el autoclave (121 °C, 15 psi, 15 min).
   1. Después del autoclave, mezcle la cantidad necesaria de urea (2 mg) con 1 ml de medio fresco y páselo a través de una jeringa equipada con un filtro de jeringa de 0,22 μm para completar el proceso de enriquecimiento.
   2. Agregue 1 ml de este medio de enriquecimiento con aditivos a los tubos de centrífuga esterilizados que contienen 9 ml del líquido de cultivo preparado (células + medio).
      NOTA: La urea, al ser degradable a temperaturas elevadas, no se puede esterilizar en un autoclave. Por lo tanto, después de que los otros componentes hayan sido esterilizados en autoclave (121 °C, 15 psi, 15 min), la urea se agrega en último lugar a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
3. Agite cada tubo a fondo con un vórtice mecánico. Coloque los líquidos enriquecidos (células + medio + aditivos) en una incubadora sin agitación a 30 °C. Controle todas las unidades regularmente para el inicio de la precipitación. Con un microscopio óptico, comience las observaciones microscópicas una vez que se detecte el inicio de la precipitación a simple vista. Esto suele ser entre 30 y 36 horas después del inicio de los experimentos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matraces de Pyrex	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Cilindro de medición	Cole-Parmer	CP08559GC	Cilindro graduado de clase A Cole-Parmer con certificado de California, TC; 1000 ml, 1 / paquete
Balanza analítica	OHAUS	AX124E	Se utiliza para medir el peso de los reactivos
Autoclave	Brinkmann	58619000
Cinta de autoclave	VWR	52428864
Papel de aluminio	Sigma-Aldrich	Z185140	Se utiliza para sellar el matraz antes de colocarlo en Autoclave
Stock bacteriano	Cedarlane	11859	-80 °C de existencias de S. pasteurii, n.º ATCC se menciona contra Cat. No.
Pipetas mecánicas monocanal Mline, volumen variable	Biohit	725010	Comercializado por VWR con el número de catálogo 14005976
Punta de micropipeta	Fisher Scientific	212772B	Se utiliza para rayar placas de agar
Incubadora	Carpeta	80079098	Incubadora de microbiología, serie BF
Incubadora de agitación	VWR	14004300	Incubadoras de vibración de sobremesa VWR Signature
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Se utiliza para sellar placas de agar
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enriquecimiento para medio nutritivo
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S8875	Enriquecimiento para medio nutritivo
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C1016	Enriquecimiento para medio nutritivo