Identificación de alto rendimiento de polímeros repelentes de bacterias mediante cribado de microarrays

Resumen

Fuente: Venkateswaran, S., et al. Identificación de alto rendimiento de polímeros repelentes de bacterias para dispositivos médicos. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra un método de alto rendimiento para identificar polímeros repelentes de bacterias utilizando un portaobjetos de microarrays expuesto a cultivos bacterianos mixtos. La unión bacteriana se evalúa mediante fluorescencia DAPI, donde la señal reducida indica polímeros con una unión superficial mínima.

Protocolo

1. Inoculación de micromatrices poliméricas con bacterias

NOTA: Asegurar una buena técnica aséptica. Toda la manipulación de cultivos debe realizarse en un ambiente estéril: ya sea con un mechero Bunsen o en una campana de flujo. Los cultivos deben cultivarse con disponibilidad de oxígeno, medio de crecimiento y temperatura ajustada a los requerimientos de cada especie.

1. Prepare cultivos durante la noche inoculando 5 ml de caldo Luria-Bertani (LB: 10 g / L de bacto-triptona, 5 g / L de cloruro de sodio, NaCl y 10 g / L de extracto de levadura) con una colonia de un plato. Incubar durante la noche a 37 °C, agitando a 200 rpm (revoluciones por minuto).
2. Preparar en el congelador los cultivos durante la noche mediante la adición de glicerol (concentración total del 10%) y almacenar el caldo a -80 °C.
3. Para determinar el número de células de las muestras de las existencias bacterianas descongeladas, realice diluciones en serie de cada cepa y cultive las bacterias durante la noche en medios sólidos. La determinación precisa del número de células en las poblaciones garantiza una inoculación adecuada de cada especie.
4. Prepare inóculos para microarrays. Los cultivos de una sola especie se cultivan como se indicó anteriormente y se aplican directamente a los microarrays. BacMix-1 es una mezcla bacteriana de Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) y Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 es una mezcla bacteriana que consiste en Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae y Enterococcus faecalis (E. faecalis).
5. Para producir cualquiera de los cultivos mixtos, mezcle durante la noche en volúmenes iguales (3 ml cada uno) y diluya cuatro veces con LB fresco (hasta aproximadamente 50 ml de volumen final).
6. Coloque microarrays de polímeros esterilizados por rayos ultravioleta en placas rectangulares de 4 pocillos e incube con 6 ml de cultivos bacterianos mixtos a 37 °C con agitación suave (30 rpm) durante 5 días.
7. Después de la incubación, enjuague suavemente los microarrays dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS: 137 mM de NaCl, 2,7 mM de cloruro de potasio, KCl, 10 mM de fosfato de hidrógeno disódico, Na₂HPO₄, 1,8 mM de fosfato de dihidrógeno de potasio, KH₂PO₄) e incube con una solución de 1 μg/ml de tinción de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS durante 30 min.
8. Lave los portaobjetos de microarrays manchados en una placa de pocillos nueva cubriendo con PBS y girando suavemente, cambiando el PBS una vez. Secar bajo un flujo de aire. Aplique un cubreobjetos de vidrio al portaobjetos de microarrays y selle en su lugar con pegamento. Una vez seco, esterilizar la superficie exterior con etanol al 70% (v/v).
9. Deseche de forma segura los cultivos de acuerdo con su nivel de contención.

2. Imágenes y análisis de microarrays

1. Capture imágenes individuales para cada punto de polímero en los canales de campo claro y DAPI (Excitación/Emisión, Ex/Em = 358 nm / 361 nm). Realice esto manualmente con un microscopio fluorescente o utilizando un microscopio de fluorescencia automatizado (con una platina X-Y-Z controlada por un software de adquisición de imágenes) equipado con un objetivo de 20X.
   NOTA: Ajuste el microscopio para obtener imágenes utilizando canales de campo claro y DAPI. Asegúrese de que la ganancia y el tiempo de exposición para la captura de imágenes para todos los microarrays sean los mismos.
2. Obtenga la intensidad de fluorescencia promedio de cada punto en el canal DAPI eligiendo el área del punto y cuantificando la fluorescencia con un software de procesamiento de imágenes.
3. Para la fluorescencia de fondo de cada punto, obtenga imágenes de los puntos de polímero en un microarray replicado incubado solo con medios sin bacterias. Deducir la fluorescencia de fondo de la intensidad del punto para obtener fluorescencia de las bacterias.
4. Calcule el valor promedio normalizado de los cuatro puntos, que representan cada polímero, utilizados para comparar la unión bacteriana de varios polímeros.
5. Identifique los polímeros que exhiben la menor unión bacteriana (fluorescencia más baja) como polímeros "exitosos".

Materiales