Aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos de una muestra de agua para análisis molecular

Resumen

Fuente: Ghadigaonkar, D. y Rath, A. Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a los antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a los antibióticos. J. Vis. Exp. (2023)

Este video demuestra el aislamiento y la preparación de bacterias resistentes a los antibióticos a partir de una muestra de agua utilizando medios selectivos. El ADN se extrae de bacterias resistentes a los antibióticos y se amplifica para identificar los genes bacterianos resistentes a los antibióticos.

Protocolo

1. Recogida y procesamiento de muestras

1. Recogida de muestras
   1. Recoja el volumen apropiado de la muestra de agua en recipientes de muestra estériles, asegurándose de que no se llene más de 3/4 del recipiente.
   2. Transportar las muestras al laboratorio en condiciones asépticas lo antes posible después de la recolección y procesarlas inmediatamente.
2. Procesamiento de muestras
   1. Filtre asépticamente la muestra de agua a través de un paño de muselina estéril para eliminar cualquier partícula.
   2. Realice diluciones en serie apropiadas del agua filtrada para su posterior análisis.

2. Estimación de la carga bacteriana total y el recuento de bacterias resistentes a los antibióticos

1. Determinación de la carga bacteriana total
   1. Suspender 18,12 g de polvo modificado con agar 2A (agar R2A) de Reasoner en 1.000 ml de agua bidestilada y disolver la mezcla calentándola. Esterilizar en autoclave la mezcla disuelta a 121 °C, 15 libras por pulgada cuadrada (psi) durante 20 min. Preparar placas modificadas con agar R2A vertiendo la cantidad adecuada de la mezcla esterilizada en autoclave en placas de Petri estériles (por ejemplo, agregar aproximadamente 20 ml de medio estéril esterilizado en autoclave a una placa de Petri estéril de 90 mm).
   2. Una vez que el medio se solidifique, distribuya uniformemente 100 μL de las diluciones apropiadas de la muestra de agua filtrada en la placa modificada de agar R2A. Realice el experimento por duplicado.
   3. Incube todas las placas anteriores a 35 - 37 °C durante 48 h (varíe la temperatura y el tiempo de incubación según el medio utilizado para el aislamiento).
   4. Exprese la carga bacteriana total en términos de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) utilizando la ecuación (1):
2. Determinación del recuento bacteriano AR
   1. Siga los pasos 2.1.1-2.1.4. Sin embargo, en lugar de agar R2A, placas modificadas, use agar R2A, placas modificadas complementadas individualmente con cinco antibióticos diferentes, a saber, cefotaxima (3 μg / ml), ciprofloxacina (0,5 μg / ml), eritromicina (20 μg / ml), kanamicina (15 μg / ml) y vancomicina (3 μg / ml).
   2. Añadir los antibióticos por separado en tubos que contengan 20 ml de agar R2A fundido estéril, modificado (con la temperatura del agar R2A fundido, modificado a ≤40 °C) para alcanzar la concentración final de antibióticos como se menciona en el paso 2.2.1.
   3. Agite para una mezcla uniforme y vierta en placas de Petri estériles antes de que el agar se solidifique. Realice el experimento por duplicado.
   4. Incube todas las placas anteriores a 35 - 37 °C durante 48 h (la temperatura y el tiempo de incubación pueden variar si se utiliza un medio diferente).
   5. Para el control de calidad y la comprobación de la eficacia de los antibióticos, esparcir 100 μL de suspensiones bacterianas de las cepas de Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 29213 en sus respectivas placas modificadas de agar R2A que contienen antibióticos (asegúrese de que la densidad del cultivo fresco utilizado para la inoculación sea densidad óptica, DO = 0,5 a 600 nm).
   6. Determine el recuento de bacterias resistentes a los antibióticos en términos de UFC/ml como se describe en el paso 2.1.4.

3. Identificación de bacterias cultivables mediante secuenciación del gen ARN ribosómico 16S (ARNr)

1. Preparación de la plantilla de ADN de los aislados para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
   1. Con un palillo de dientes estéril, tome una colonia única, aislada y pura del aislado que crece en una placa de Petri. Suspender la colonia bacteriana en 100 μL de agua estéril de doble destilación en un tubo de microcentrífuga estéril y hervir durante 10 min.
   2. Centrifugar la suspensión a 10.000 × g durante 2 min para granular los residuos y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril fresco para utilizarlo como plantilla de ADN crudo.
2. Amplificación por PCR dirigida de la región V3 del gen 16S rRNA y secuenciación
   1. Prepare 40 μL de la mezcla de reacción en un tubo de PCR para la amplificación de PCR, como se menciona en la Tabla 1.
      NOTA: La preparación de ADN debe realizarse en un bloque de hielo minimizando la posibilidad de contaminación (use guantes mientras manipula los reactivos y limpie bien la superficie de trabajo con etanol al 70%).
   2. Coloque el tubo en el bloque térmico y ejecute el programa apropiado en el termociclador de PCR. Consulte la Tabla 2 para conocer las condiciones de ciclo de PCR estandarizadas y la información del cebador para la amplificación de las regiones V3 de los genes de ARNr 16S.

Tabla 1: Componentes de la mezcla maestra de PCR. La composición de la mezcla de reacción de varios reactivos de PCR.

Reactivos de PCR	Volumen (μL)
2x Taq Master Mix	20
Imprimación directa (10 pico mole)	1.5
Imprimación inversa (10 pico mole)	1.5
Plantilla de ADN crudo	1.5
Agua estéril de biología molecular	15.5
Volumen total	40

 

 

 

 

 

 

 

Tabla 2: Condiciones del ciclo de PCR para la amplificación del gen 16S rRNA. Se muestran las condiciones del ciclo de PCR requeridas para la amplificación del gen 16S rRNA. Los pasos incluyen un paso de desnaturalización inicial, seguido de 35 ciclos de desnaturalización, recocido y extensión, y un paso de extensión final.

Dirección	Secuencia de cebadores 5' – 3'	Condiciones de PCR	No. de ciclos
Adelante	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94 °C durante 10 min	1
		Desnaturalización a 94 °C durante 30 s	35
		Recocido a 50 °C durante 30 s
		Extensión a 72 °C durante 40 s
Marcha atrás	CTACCGGGGTATCTAATCC	Extensión final a 72 °C durante 5 min	1

Materiales