Un sistema de cocultivo para estudiar las respuestas moleculares de las plantas hospedadoras y las bacterias que interactúan

En este artículo

Resumen

Fuente: Nathoo, N., et al. Un sistema de cocultivo hidropónico para el análisis simultáneo y sistemático de las interacciones moleculares y la señalización de plantas / microbios. J. Vis. Exp. (2017).

Este video demuestra un sistema de cocultivo hidropónico para estudiar las interacciones planta-bacteria en condiciones estériles. Las plántulas de plantas se transfieren a un medio de crecimiento estéril y ácido, se incuban y se inspeccionan para detectar contaminación antes de la inoculación con Agrobacterium. Las bacterias activadas se adhieren a las raíces de las plantas, transfieren ADN-T a las células vegetales y promueven cambios moleculares que mejoran la colonización bacteriana.

Protocolo

1. Sistema de cocultivo hidropónico

Preparar medio líquido de Murashige y Skoog (MS): 2,165 g/L de sales basales MS, 10 g/L de sacarosa, 0,25 g/L de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) y 59 mL/L de mezcla de vitaminas B5, pH 5,75.
Autoclave el medio. Vierta 18 ml en cada tanque estéril de vidrio cilíndrico o plástico transparente (platos cristalizantes, 100 x 80 mm2) con tapas estériles.
NOTA: Preesteriliza los tanques y las tapas envolviéndolos en papel de aluminio y esterilizando en autoclave.
En una campana de flujo esterilizada, use fórceps estériles para transferir suavemente cada cuadrado de malla con plántulas de 10 a 14 días del medio semisólido a un tanque cilíndrico hidropónico (Figura 1d). Selle las tapas de los tanques con cinta quirúrgica porosa.
Cultivar las plántulas en la malla del tanque durante 72 h a 22-24 °C, con un fotoperiodo de 16 h y agitando a 50 rpm para aireación (Figura 1e).
NOTA: Esto permite que las plantas se adapten al ambiente hidropónico antes de la inoculación (cocultivo) con microorganismos. Este período de espera también permitirá que la contaminación microbiana accidental sea evidente antes de la inoculación.
1. Comience el siguiente paso el día anterior al final del período de incubación.
Cultivar Agrobacterium tumefaciens en medio agrobacterium (AB) (0,5% p/v de extracto de levadura, 0,5% p/v de triptona, 0,5% p/v de sacarosa, 50 mM MgSO₄, pH 7,0) a 28 °C agitando durante la noche hasta que el cultivo alcance una densidad óptica final de 1,0 a 600 nm (OD₆₀₀), medido con un espectrofotómetro, con medio AB no inoculado como blanco.
NOTA: Un DO₆₀₀ de 1,0 equivale a aproximadamente 10⁹ células/ml.
Lavar el A. tumefaciens tres veces en un volumen igual de NaCl al 0,85%. Vuelva a suspender en un volumen igual de agua estéril de doble destilación.
Antes de la inoculación, examine cuidadosamente el tanque con plántulas para asegurarse de que no haya contaminación; El medio en los tanques no contaminados debe ser claro y transparente.
1. Deseche cualquier tanque con líquido turbio (contaminación) y numere el resto de los tanques. Pruebe una pequeña cantidad (20 μL) de medio hidropónico de cada tanque numerado y colóquelo en una placa de Petri llena de caldo Luria (LB). Incubar el plato a 28 °C.
Inmediatamente, agregue 50 μL de la suspensión de A. tumefaciens (aproximadamente 5 x 10 7 células, estimadas a partir del OD₆₀₀) en cada tanque hidropónico numerado. Cocultivar las plántulas de Arabidopsis thaliana y A. tumefaciens a 22-24 °C con un fotoperíodo de 16 h y agitando a 50 rpm (Figura 3f).
1. Examine la placa LB manchada del paso 1.7.1. después de 12 y 28 h de incubación para verificar la esterilidad de los tanques. Si hay alguna contaminación, no utilice el tanque numerado correspondiente (inoculado con bacterias) para realizar ensayos posteriores.
Si lo desea, controle el crecimiento de A. tumefaciens a intervalos regulares extrayendo una muestra de medio del tanque y midiendo el OD₆₀₀ usando un espectrofotómetro con medio de un control no inoculado como blanco (Figura 2).
NOTA: Los síntomas de la enfermedad de las plantas deben ser evidentes después de 7 días (Figura 3).

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Resultados

Figura 1: Sistema de cocultivo hidropónico planta-microbio. El panel izquierdo representa un diagrama de flujo que describe los seis pasos clave para ensamblar y operar el sistema de cocultivo hidropónico. El panel de la derecha demuestra los m...