Aquí se demuestra un protocolo para llevar a cabo la tinción de células vivas que se pueden utilizar para detectar los receptores de olor en la superficie de las células HEK293T convenientemente. Además, también puede ser utilizado para el ensayo de expresión en la superficie de otros receptores o quimiosensoriales GPCRs.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Analizando la expresión de superficie de los receptores Quimiosensoriales en células heterólogas
En este artículo
Resumen
Resumen
El vívido mundo de los olores es reconocido por el sentido del olfato. El olfato de los ratones es mediada por un repertorio de alrededor de 1.200 receptores acoplados a proteínas G (GPCR) 1 que se postulan para unirse las moléculas volátiles de olor y la conversión de la señal extracelular en una señal intracelular mediante el acoplamiento con la proteína G Gαolf. La unión de los olores de los receptores se cree que siguen una regla combinatoria, es decir, un olor puede obligar a varios receptores y un receptor puede unirse olores varios en distintos grados 2. Señalización bioquímica, y ligando los estudios de unión han sido convenientemente llevado a cabo para la mayoría de los GPCRs utilizando células heterólogas. Sin embargo el uso de células heterólogas para el estudio de los receptores de olor, fue excluida por mucho tiempo ya que en la transfección no pudieron exportar a la superficie. Saito et al han demostrado receptores de membrana de una sola pasada de Transporte de proteínas (RTP) acompañantes de la familia muestran una mayor expresión en las neuronas olfativas sensoriales y actuar como acompañantes a los receptores de olor de tráfico a la superficie en células heterólogas, cuando co transfectadas juntos 3. Para llevar a cabo los análisis bioquímicos de los receptores con células heterólogas, primero hay que determinar si el receptor muestra la expresión de superficie sólida en la línea celular. Esto se puede probar por sobreexpresión de los receptores con el RTP1S acompañante seguido por tinción de células vivas para la etiqueta fluorescente el dominio extracelular o una etiqueta en el dominio extracelular de forma exclusiva. Aquí se demuestra un protocolo para llevar a cabo la tinción de células vivas que se pueden utilizar para detectar los receptores de olor en la superficie de las células HEK293T convenientemente. Además, también puede ser utilizado para el ensayo de expresión en la superficie de otros receptores o quimiosensoriales GPCRs.
Protocolo
1. Procedimiento:
El procedimiento consta de tres partes completadas en un tiempo total de 3 días: la transferencia de células, transfección y la inmunocitoquímica, un paso llevado a cabo al día. Transferencia y la transfección de células en los dos primeros días se llevó a cabo en condiciones estériles en una cámara de flujo laminar.
Día 1: Traslado de las células HEK293T para el ensayo de la superficie de la expresión.
- Medio de transmisión (M10): Mezclar medio mínimo esencial suplementado con 10% (en volumen) de suero fetal bovino en condiciones estériles.
- Se cultivan las células a una conf....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Cada paso debe ser realizado cuidadosamente para asegurarse de tinción de la superficie importante y distintivo. El proceso de tinción completa debe ser llevado a cabo en frío (sobre hielo), y la bandeja en la que se establecen cubreobjetos debe ser enfriado antes de su uso para asegurar las células sobrevivir. Por otra parte la fijación se realiza al final del proceso de tinción de la superficie. Esto está en agudo contraste con la tinción de interior en el que precede a la fijación de tinción para permeabilizar las me.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros de Matsunami de laboratorio para la lectura crítica de este manuscrito.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cubreobjetos de 22 x 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Suero bovino fetal | GIBCO, por Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Medio mínimo esencial | Sigma-Aldrich | M4655 | Con L-glutamato, sales de Earle’s y bicarbonato |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehído | EMS | 19208 | |
| Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) 1X | GIBCO, por Life Technologies | 14025 | Con cloruro de calcio y cloruro de magnesio |
| Solución tampón HEPES | GIBCO, por Life Technologies | 15630 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Sin calcio ni magnesio |
| Poli-D-lisina hidrobromuro | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Azida sódica | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Placa de cultivo celular de 35 x 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Tripsina-EDTA | GIBCO, por Life Technologies | 25300 | 0,05% |
Referencias
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H.....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
