Preparación de esferoplastos de E. coli

Resumen

Fuente: Figueroa, D. M., et.al. Producción y visualización de esferoplastos y protoplastos bacterianos para caracterizar la localización de péptidos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la producción de esferoplastos de Escherichia coli inhibiendo primero la división celular para inducir la filamentación, seguida de la digestión enzimática de la pared celular. El proceso incluye la adición controlada de un agente quelante, DNasa y un estabilizador osmótico para garantizar la formación y estabilidad adecuadas de esferoplastos para la observación microscópica.

Protocolo

1. Preparación de la solución

1. Preparar 1 M de Tris-Cl, pH 7,8 disolviendo 10,34 g de Tris HCl y 4,17 g de Tris OH en 50 mL de dH₂O en un matraz de 125 mL. Esterilizar filtrando a través de un filtro de jeringa de 25 mm con membrana de 0,2 μm y almacenar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
2. Preparar la solución A (20 mM MgCl₂, 0,7 M sacarosa, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) disolviendo 0,10 g MgCl₂ (95,2 g/mol) y 11,98 g de sacarosa (342,3 g/mol) en 25 mL dH₂O en un matraz de 125 mL. Agregue 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) y ajuste el volumen a 50 mL. Esterilizar filtrando a través de un filtro de jeringa de 25 mm con membrana de 0,2 μm y almacenar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
3. Preparar la solución B (10 mM MgCl₂, 0,8 M sacarosa, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) disolviendo 0,05 g MgCl₂ (95,2 g/mol) y 13,69 g de sacarosa (342,3 g/mol) en 25 mL dH₂O en un matraz de 125 mL. Agregue 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) y ajuste el volumen a 50 mL. Esterilizar filtrando a través de un filtro de jeringa de 25 mm con membrana de 0,2 μm y almacenar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
4. Preparar sacarosa 0,8 M disolviendo 13,69 g de sacarosa (342,3 g/mol) en 50 mL dH₂O en un matraz de 125 mL. Esterilizar filtrando a través de un filtro de jeringa de 25 mm con membrana de 0,2 μm y almacenar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
5. Preparar 5 mg/ml de desoxirribonucleasa I (DNasa I) disolviendo 0,015 g de ADNasa I en 3 ml de dH₂O en un matraz de 50 ml. Esterilice filtrando a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana de 0,2 μm. Alícuotas en tubos de microfuga y almacenar a -20 °C.
6. Preparar ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,125 M, pH 8,0 disolviendo 0,698 g de EDTA disódico deshidratado (372,2 g/mol) en 15 mL dH₂O en un matraz de 125 mL. Esterilizar filtrando a través de un filtro de jeringa de 25 mm con membrana de 0,2 μm y almacenar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
7. Preparar 600 μg/ml de cefalexina disolviendo 0,03 g de hidrato de cefalexina (365,404 g/mol) en 50 ml de dH₂O en un matraz de 125 ml. Esterilizar filtrando a través de un filtro de jeringa de 25 mm con membrana de 0,2 μm y almacenar en un tubo cónico a 4 °C.
8. Preparar 5 mg/ml de lisozima disolviendo 0,015 g de lisozima en 3 ml de dH₂O en un matraz de 50 ml. Esterilice filtrando a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana de 0,2 μm. Alícuotas en tubos de microfuga y almacenar a -20 °C.
9. Preparar el caldo de soja tripticasa (TSB) al 3% p/v disolviendo 30 g de TSB en 1 L de dH₂O en un matraz de 2 L. Alícuota de la solución en matraces que contengan 25 ml o 100 ml de TSB para su uso en la preparación de esferoplastos de E. coli . Matraces de autoclave para esterilizar el medio líquido. El TSB estéril se puede almacenar a temperatura ambiente o a 4 °C.

2. Preparación de cultivo durante la noche

NOTA: Realice las secciones 2-3 utilizando técnicas estériles adecuadas. Si se desea, una cepa bacteriana puede contener un plásmido para la resistencia a los antibióticos para reducir la contaminación potencial. Si usa una cepa con resistencia a los antibióticos, agregue los antibióticos necesarios en los pasos 2.1 y 3.1-3.2.

1. Prepare un cultivo durante la noche recogiendo una sola colonia de bacterias con una punta de pipeta estéril y colocándola en un tubo de cultivo de 14 ml que contenga 2-3 ml de TSB al 3% p/v. Incubar a 37 °C, agitando durante 16-21 h.

3. Preparación de esferoplastos gramnegativos de E. coli

1. En un matraz de 250 ml, diluir el cultivo nocturno 1:100 en un volumen de 25 ml de TSB al 3% p/v e incubar la solución bacteriana a 37 °C, agitando durante aproximadamente 2,5 h hasta que la solución haya alcanzado una densidad óptica de 0,5-0,8 a 600 nm. Mida la densidad óptica con un espectrofotómetro.
2. En un matraz de 250 ml, diluir este cultivo 1:10 en 30 ml de TSB al 3% p/v e incubar a 37 °C, mientras agita durante 2,5 h en presencia de 60 μg/ml de cefalexina (347,4 g/mol) para producir filamentos unicelulares de aproximadamente 50-150 μm de longitud, que son observables con un aumento de 1.000X utilizando un microscopio óptico (Figura 1B).
3. Recolecte los filamentos centrifugando la solución bacteriana a 1.500 x g, 4 °C durante 4 min. Decantar y desechar el sobrenadante, reservando el pellet.
4. Lave los filamentos agregando suavemente 1 ml de sacarosa 0,8 M, teniendo cuidado de no alterar el gránulo. Incube durante 1 minuto y luego deseche el sobrenadante sin alterar el gránulo.
5. Agregue 150 μL de Tris-Cl 1 M (pH 7,8), 120 μL de lisozima 5 mg/mL, 30 μL de ADNasa I de 5 mg/mL y 120 μL de EDTA 0,125 M en su orden respectivo al pellet e incube la solución a temperatura ambiente durante 10 min.
6. Añadir 1 ml de solución A gradualmente durante 1 min a la solución preparada en 3,5 con una micropipeta mientras se agita suavemente la solución a mano. Incube la solución durante 4 min a temperatura ambiente.
7. Ponga 7 ml de solución B a 4 °C en dos tubos cónicos de 15 ml. Agregue cantidades iguales de la solución preparada en 3.6 a cada uno de estos dos tubos. Centrifugar la solución a 1.500 x g, 4 °C durante 4 min.
8. Con una pipeta serológica, retire con cuidado todo menos 1-2 ml de sobrenadante sin alterar el sedimento. Vuelva a suspender el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta P1000. Verifique visualmente la formación de esferoplastos observando la muestra con un aumento de 1,000X con un microscopio óptico (Figura 1C).
9. Almacene los esferoplastos a -20 °C durante un máximo de una semana o hasta que hayan pasado por 3 ciclos de congelación y descongelación.

Resultados

Figura 1: Imágenes representativas de E. coli. (A) Bacteria E. coli (B) E. coli serpiente y (C) E . coli esferoplasto. Las imágenes ...

Materiales