Generación de protoplastos a partir de la bacteria grampositiva Bacillus megaterium

Resumen

Fuente: Figueroa, D. M., et al. Producción y visualización de esferoplastos y protoplastos bacterianos para caracterizar la localización de péptidos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra un procedimiento paso a paso para generar protoplastos a partir de la bacteria grampositiva Bacillus megaterium.

Protocolo

1. Preparación de la solución

1. Preparar 5 mg/ml de lisozima disolviendo 0,015 g de lisozima en 3 ml de dH₂O en un matraz de 50 ml. Esterilice filtrando a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana de 0,2 μm. Alícuotas en tubos de microfuga y almacenar a -20 °C.
2. Preparar el caldo de soja tripticasa (TSB) al 3% p/v disolviendo 30 g de TSB en 1 L de dH₂O en un matraz de 2 L. Alícuota de la solución en matraces que contengan 100 ml de TSB para su uso en la preparación de protoplastos de B. megaterium . Matraces de autoclave para esterilizar el medio líquido. El TSB estéril se puede almacenar a temperatura ambiente o a 4 °C.
3. Preparar la solución C (sacarosa 1 M, maleato 0,04 M, 0,04 M MgCl₂, pH 6,5) disolviendo 34,23 g de sacarosa (342,3 g/mol), 0,46 g de ácido maleico (116,07 g/mol) y 0,38 g de MgCl₂ (95,21 g/mol) en 100 ml de dH₂O en un matraz de 250 ml. Ajuste el pH a 6.5. Esterilizar filtrando a través de un filtro de jeringa de 25 mm con membrana de 0,2 μm y almacenar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
4. Prepare 200 ml de medio de protoplasto mezclando 100 ml al 3% con TSB y 100 ml de solución C en una botella de vidrio de 1 l. Autoclave para esterilizar la solución y almacenar a temperatura ambiente.

2. Preparación de protoplastos Gram-positivos de B. megaterium

1. En un matraz de 250 mL, diluir el cultivo nocturno 1:1.000 en 100 mL de TSB al 3% p/v e incubar la solución bacteriana a 37 °C, agitando durante aproximadamente 4,5 h hasta que la solución haya alcanzado una densidad óptica de 0,9-1,0 a 600 nm. Mida la densidad óptica con un espectrofotómetro.
2. Verter el cultivo líquido en dos tubos cónicos de 50 ml y centrifugar a 2.000 x g, 4 °C durante 10 min.
3. Con una pipeta serológica, deseche el sobrenadante de ambos tubos cónicos. Vuelva a suspender cada gránulo en medio de protoplasto de 2,5 ml y combine las soluciones resuspendidas en un solo tubo cónico. Pipetee la solución resuspendida combinada en un matraz de 125 ml.
4. Añadir 1 ml de lisozima 5 mg/ml e incubar durante 1 h a 37 °C, mientras se agita.
5. Monitoree el crecimiento de los protoplastos con un aumento de 1,000x con un microscopio óptico, observando cualquier irregularidad, como bacterias que aparecen como bastones hinchados en lugar de esferas (Figura 1). Con una pipeta serológica, transfiera la solución a un tubo cónico de 15 ml y centrifugue a 2.000 x g, 4 °C durante 10 min.
6. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 5 ml de medios de protoplastos. Almacene los protoplastos a -20 °C durante un máximo de una semana o hasta que hayan pasado por 3 ciclos de congelación y descongelación.

Resultados

Figura 1: Imágenes representativas de B. megaterium. (A) bacterias B. megaterium y (B) protoplasto B. megaterium . Las imágenes se tomaron con un aumento...

Materiales