Evaluación de la transcitosis de E. coli a través de monocapas epiteliales intestinales

Resumen

Fuente: Islam, A., et al., Evaluación de la transcitosis intestinal de aislados neonatales de bacteriemia por Escherichia coli . J. Vis. Exp. (2023)

Este video demuestra el procedimiento para evaluar la transcitosis de Escherichia coli neonatal a través de monocapas epiteliales intestinales utilizando insertos de transpocillos, medición de resistencia eléctrica y cuantificación bacteriana.

Protocolo

1. Inoculación de las células (inicio del experimento)

1. Después de exactamente 2 h, retire los cultivos bacterianos de la mañana del agitador y centrítelos durante 10 min (1.900 x g, 4 °C).
   NOTA: Para todos los pasos siguientes, mantenga todas las suspensiones bacterianas en hielo para minimizar el crecimiento.
2. Vuelva a suspender el gránulo de bacterias en el medio de cultivo de tejidos (MTC) sin antibióticos. Use un espectrofotómetro para ajustar la densidad óptica (OD) a 0.7-0.9 y diluya aún más con TCM sin antibióticos a una concentración de 1 x 10⁶ unidades formadoras de colonias (UFC) / ml (dilución aproximadamente 1:100). Utilice esta suspensión bacteriana para infectar cada inserto con 1 x 10⁵ UFC por volumen de 100 μl.
3. Etiquete la placa de transpocillos e infecte cada inserto con 100 μL del inóculo ajustado por OD (un total de 1 x 10⁵ UFC por inserto). El ensayo ya ha comenzado. Anote el tiempo y regístrelo como t = 0 h.
4. Coloque la suspensión bacteriana de inóculo para cuantificar la UFC/ml utilizando el método de dilución de pistas, sembrando alícuotas de 10 μL en placas cuadradas de agar LB.

2. Cuantificación de la transcitosis

1. Cada 30 minutos después de la inoculación, llene los pocillos nuevos con 500 μL de MTC sin antibióticos. Transfiera los insertos a estos nuevos pocillos utilizando un juego diferente de pinzas estériles para cada cepa bacteriana diferente.
2. Recoja los medios del pozo de recolección usado para cada inserto en tubos etiquetados separados. Coloque estos tubos en hielo. Entre los puntos de tiempo, devuelva las placas de transpocillos a la incubadora.
3. Para cada inserto, combine los medios recolectados de t = 0.5 h, t = 1 h, t = 1.5 h y t = 2 h, y vórtice brevemente. Coloque los medios recolectados en placas de agar Luria-Bertani (LB) utilizando el método de dilución de pistas para cuantificar la cantidad de bacterias transcitadas en las primeras 2 h del experimento.
   NOTA: Recuperar las bacterias cada 30 minutos y mantenerlas en hielo minimiza el crecimiento bacteriano en los pozos colectores, y las mediciones se realizan predominantemente en bacterias de transcitosis.
4. Coloque las placas de agar LB de dilución de pista marcadas en la incubadora bacteriana a 37 °C sin CO₂ suplementario y devuelva la placa transpocillo T84 a la incubadora de cultivo de tejidos.
5. A t = 4 h, repita el paso 2.3 combinando los medios recolectados de t = 2.5 h, t = 3 h, t = 3.5 h y t = 4 h.
6. A t = 6 h, repita el paso 2.3 combinando los medios recolectados de t = 4.5 h, t = 5 h, t = 5.5 h y t = 6 h. Además, a t = 6 h, coloque en placas los medios de los pocillos de control.

3. Fin del experimento

1. Mida y registre la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) al final del experimento, t = 6 h.
2. Descontamine la sonda sumergiéndola en etanol al 70% durante 10-15 min. Si lo desea, deseche los insertos o guárdelos / procéselos para aplicaciones adicionales. Deje que las placas de agar LB se incuben durante la noche y desinfecte y / o deseche de manera segura todos los demás materiales utilizados.
3. Después de la incubación durante la noche, cuente las colonias bacterianas manualmente en las placas LB de dilución de la pista para determinar la cantidad de inóculo y la cantidad de transcitosis de E. coli . Asegúrese de que las placas de control no muestren ningún crecimiento bacteriano.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos cónicos estériles de 15 ml	MidSci	C15B
Tubos de microcentrífuga de 2 ml	Avant	AVSS2000
Tubos cónicos de polipropileno estériles de 50 ml	Halcón	352070
Centrífuga	Sorvall	Leyenda RT
Asas de inoculación desechables	Marca de pescador	22363605
Medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco	Gibco	11965-084
Voltímetro epitelial / ohmio	Instrumentos de precisión del mundo	EVOM
Agitador de incubadora	New Brunswick	Innova 4080
Incubadoras	Thermo Scientific	51030284	Tres de estos se utilizan en el método: uno para el cultivo de tejidos estériles, uno para el cultivo de tejidos infectados y otro para la incubación bacteriana.
Caldo de lisogenia	Difco	244610
Agar caldo de lisogenia	IBI Científico	IB49101
Espectrofotómetro	Único	1100RS
Células intestinales T84	Colección de cultivos de tejidos estadounidenses	CCL248
Insertos de cultivo de tejidos, con membrana de trepactato de polietileno, poros de 3 μm, formato de 24 pocillos	Halcón	353096
Placa de cultivo de tejidos, 24 pocillos	Halcón	353504