Preparación e inducción de cultivos de Borrelia burgdorferi para la producción de partículas virales

Resumen

Fuente: Eggers, C. H. Manipulación genética mediada por fagos de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra la preparación de un cultivo de Borrelia burgdorferi modificado genéticamente diseñado con ADN de bacteriófago latente que porta un gen de resistencia a los antibióticos. Después de la selección e incubación de antibióticos, un inductor químico desencadena daños en el ADN, lo que lleva a la escisión, replicación y ensamblaje de nuevos viriones que contienen el gen de resistencia. Después de una segunda centrifugación y resuspensión, las células bacterianas que albergan partículas virales maduras están listas para aplicaciones posteriores.

Protocolo

1. Preparación del cultivo de B. burgdorferi para la producción de φBB-1

1. Prepare el medio Barbour-Stoenner-Kelly suplementado con un 6,6% de suero de conejo normal inactivado por calor (BSK). Para 1 L de 1x BSK, combine los componentes enumerados en la Tabla 1 en 900 ml de agua, ajuste el pH a 7,6 con hidróxido de sodio 1 N y mezcle lentamente a 4 °C durante 2-4 h. Una vez completada la mezcla, verifique y reajuste el pH a 7.6 si es necesario, y aumente el volumen a 1 L con agua. Esterilice el medio pasando por un filtro de 0,22 μM (consulte la tabla de materiales) y utilícelo fresco o guárdelo a 4 °C durante ≤2 meses.
2. De tres a cinco días antes de comenzar el protocolo de transducción, inocular 150 μL de los clones apropiados de B. burgdorferi en 15 mL de 1x BSK en tubos de centrífuga cónicos estériles bien tapados (ver Tabla de Materiales). Complementar el medio con la concentración adecuada de antibióticos o una combinación de antibióticos para la selección y el mantenimiento del ADN heterólogo dentro de los clones de B. burgdorferi (Tabla 2).
   NOTA: B. burgdorferi es un organismo de nivel 2 de bioseguridad. Tome todas las precauciones apropiadas al trabajar con este organismo. Realice todo el trabajo con cultivos vivos de B. burgdorferi en un gabinete de bioseguridad de clase II certificado y debidamente desinfectado. Deseche adecuadamente todo el material que entre en contacto con B. burgdorferi y los propios organismos según las pautas de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC).
3. Incubar los cultivos a 33 °C sin agitar hasta que los cultivos alcancen una densidad de ≥5 × 10⁷ espiroquetas·mL⁻¹, lo que tarda aproximadamente 3-5 días.

3. Inducción del fago B. burgdorferi φBB-1

NOTA: Esterilice toda la cristalería y los artículos de plástico en autoclave; esterilizar todas las soluciones mediante autoclave o filtración a través de un filtro de 0,22 μM. Los pasos a continuación se presentan en función de volúmenes de 15 ml, pero el método es escalable a volúmenes más pequeños o más grandes según las necesidades individuales del experimento.

1. Para el cultivo de B. burgdorferi a partir del cual se producirá el fago (el donante), use la concentración calculada por cualquiera de los métodos en el paso 2 para determinar el volumen de cultivo iniciador necesario para producir 4 ml de 2 ×^{10 8} espiroquetas·mL⁻¹. Esto producirá una concentración final de 5 × 10⁷ espiroquetas·mL⁻¹ en 15 mL durante la etapa de recuperación (paso 3.6 a continuación).
2. Centrifugar el volumen de cultivo calculado en el paso 3.1 a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 4 ml de BSK fresco. Transfiera la muestra al tubo estéril más pequeño disponible para contener la muestra con un espacio de cabeza mínimo.
3. Agregue la cantidad adecuada de agente inductor a la concentración recomendada (Tabla 3) basada en un volumen de cultivo de 4 ml para inducir la producción de fagos. Tape bien el tubo y mezcle bien.
4. Incubar la muestra a 33 °C durante 2-4 h.
5. Después de la incubación, transfiera la muestra a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar la muestra a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante.
6. Vuelva a suspender el sedimento celular en 15 ml de 1x BSK.

Tabla 1: BSK para el cultivo y selección de clones de B. burgdorferi para ensayos de transducción. La formulación y preparación de 1x BSK para el cultivo de B. burgdorferi y 1,5x BSK para la selección en fase sólida de clones de B. burgdorferi descritos aquí se basan en Samuels. Aún no se han probado diferentes formulaciones de BSK (o MKP) que apoyan el crecimiento de B. burgdorferi utilizando el ensayo de transducción.

Componente	1x BSK (para cultivo) (1 L)	1,5x BSK (para enchapado) (1 L)
Albúmina sérica bovina (fracción V)	35 gramos	52,5 gramos
10x CMRL-1066 (sin L-glutamina)	8 gramos	12 gramos
Neopeptona	4 gramos	6 gramos
levadura	1,6 gramos	2,4 gramos
HEPES	4,8 gramos	7,2 gramos
Glucosa	4 gramos	6 gramos
Citrato de sodio	0,56 gramos	0,84 gramos
Piruvato de sodio	0,64 gramos	0,96 gramos
N-acetil-glucosamina	0,32 gramos	0,48 gramos
Bicarbonato de sodio	1,76 gramos	2,64 gramos
Suero de conejo normal inactivado por calor (INRS)	66 ml	99 ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tabla 2: Antibióticos potenciales y concentraciones que se utilizarán para la selección y mantenimiento de ADN heterólogo en B. burgdorferi. Esta lista se basa en los marcadores actuales de resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en Borrelia burgdorferi. La kanamicina, la gentamicina y la estreptomicina se preparan en agua, se esterilizan por filtro a través de un filtro de 0,22 μM y se almacenan a -20 °C. La eritromicina se prepara en etanol al 95% y se almacena a -20 °C. Muchos laboratorios informan del uso exitoso de kanamicina para la selección a una concentración de 200 μg·mL⁻¹; cuando se usa gentamicina y kanamicina para la selección en ensayos de transducción, se usa 400 μg · mL⁻¹ de kanamicina. El gen aadA confiere resistencia tanto a la estreptomicina como a la espectinomicina. Para la selección de construcciones que contienen el gen aadA en E. coli, se utiliza 100 μg·mL⁻¹ de espectinomicina. Tenga en cuenta que los aminoglucósidos (kanamicina, gentamicina y estreptomicina) no son clínicamente relevantes en el tratamiento de la enfermedad de Lyme; sin embargo, la eritromicina se usa clínicamente en ciertas situaciones. Aunque se ha informado resistencia natural a este antibiótico en B. burgdorferi , este marcador de resistencia no se ha utilizado hasta ahora en los ensayos de transducción informados aquí.

Antibiótico	Concentración de existencias	Concentración final en la cultura de Bb
Kanamicina	100 mg.mL-1 (en agua)	200-400 μ g.mL-1
Gentamicina	50 mg.mL-1 (en agua)	50 μ g.mL-1
Estreptomicina	50 mg.mL-1 (en agua)	50 μ g.mL-1
Eritromicina	2 mg.mL-1 (en EtOH)	0,06 μ g.mL-1

 

 

 

 

 

Tabla 3: Agentes inductores potenciales y concentraciones utilizadas para la inducción de φBB-1 de B. burgdorferi. Se ha demostrado que la N-metil-N′-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), la mitomicina C y el etanol, así como el metanol y el isopropanol, inducen φBB-1 por encima de los niveles constitutivos en la cepa CA.11-2A de B. burgdorferi . MNNG es un riesgo cancerígeno y ambiental sospechoso; Úselo con precaución, disuelva en un solvente combustible e incinere para su eliminación. La mitomicina C es un carcinógeno sospechoso y un peligro ambiental potencial; Úselo con precaución debajo de una campana extractora de productos químicos y deséchelo adecuadamente. Si bien los datos publicados sugieren que MNNG es el agente más efectivo para inducir φBB-1, los peligros de trabajar con este químico y las dificultades para adquirirlo complican su uso, particularmente con los estudiantes. La inducción con etanol es consistentemente mejor que con metanol o isopropanol y se ha utilizado con mayor frecuencia en el ensayo de transducción.

Agente inductor	Concentración de pasta (disolvente)	Concentración final en la muestra
Etanol	100% (ninguno)	5%
Mitomicina C	2 mg.mL-1 (agua)	20 μ g.mL-1
1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG)	50 mg.mL-1 (DMSO)	10 μ g.mL-1

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Unidades de filtro de 1 L (PES, tamaño de poro de 0,22 μm)	Millipore Sigma	S2GPU10RE
Tubo de 12 mm x 75 mm (tapa de doble posición) (polipropileno)	USA Científico	1450-0810	contiene 4 ml con bajo volumen de vacío (para inducción)
Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml (polipropileno)	USA Científico	5618-8271
1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG)	Millipore Sigma		PRECAUCIÓN: potencial carcinógeno; ya no está disponible, no se ha probado el sustituto ofrecido
Pipetas Pasteur de 5,75" (taponadas de algodón/vidrio de borosilicato/no estériles)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	Autoclave antes de su uso
Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml (polipropileno)	USA Científico	1500-1211
Etanol absoluto
Bacto Neopeptona	Gibco	DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate	Gibco	255772
Albúmina sérica bovina (grado de reemplazo sérico)	Bioproductos Gemini	700-104P
CMRL-1066 sin L-glutamina (polvo)	Biológica de EE. UU.	C5900-01	Grado de cultivo celular
Eritromicina	Research Products International Corp	E57000-25.0
Solución de reactivo de gentamicina	Gibco	15750-060
Glucosa (dextrosa anhidra)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Sulfato de kanamicina	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0
Millex-GS (tamaño de poro de 0,22 μM)	Millipore Sigma	SLGSM33SS	para filtrar, esterilizar antibióticos y otras soluciones de pequeño volumen
Mitomicina C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	PRECAUCIÓN: potencial carcinógeno; Úselo solo en una campana extractora química
N-acetil-D-glucosamina	MP Biomédica, LLC	100068
Placa de Petri (100 mm × 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Suero de conejo no estéril con trazas hemolizadas (NRS)	Productos biológicos Pel-Freez	31119-3	Inactivar el calor según las instrucciones del fabricante
Bicarbonato de sodio	Thermo Fisher Scientific	BP328-500
Piruvato de sodio	Millipore Sigma	P8674-25G
Solución de sulfato de estreptomicina	Millipore Sigma	S6501-50G
Citrato trisódico dihidratado	Millipore Sigma	S1804-500G	citrato de sodio para BSK