Detección de un analito objetivo mediante un biosensor bacteriano

Resumen

Fuente: Barber, A. E., et al. Preparación y aplicación de un nuevo biosensor bacteriano para la detección presuntiva de residuos de disparos. J. Vis. Exp. (2019).

Este video demuestra la detección de analitos específicos utilizando un biosensor bacteriano. Se toma un cultivo bacteriano que lleva un plásmido con un gen de proteína fluorescente roja (RFP) bajo un promotor sensible al analito. Después de limpiar a fondo la superficie de prueba, una pequeña sección de la toallita se sumerge en el cultivo y se incuba. La interacción del analito con el promotor activa la expresión de RFP, confirmando la presencia del analito objetivo.

Protocolo

NOTA: Se presenta la síntesis de E. coli que expresa la proteína fluorescente roja (RFP).

1. Preparación de ácido desoxirribonucleico (ADN) plasmídico a partir de E. coli

1. Descongele E. coli que contenga un plásmido con un gen RFP y un gen de resistencia a la ampicilina, y cultive la E. coli en placas de agar Luria Broth (LB) que contengan 100 μg / ml de ampicilina a 37 ° C durante 24 h. Por ejemplo, use el plásmido J10060 del registro de partes biológicas estándar utilizadas para biología sintética (consulte la Tabla de materiales). El plásmido J10060 incluye un gen para RFP bajo el control de una región promotora de pBad y un gen de resistencia a la ampicilina. Alternativamente, transforme E. coli (consulte el paso 3.2) con el plásmido antes del crecimiento en las placas de agar LB.
2. Siga un protocolo estándar de minipreparación (consulte la Tabla de materiales) para aislar el ADN de 1 ml de un cultivo de E. coli que contiene el plásmido J10060. El propósito del siguiente protocolo es eliminar el promotor pBad y reemplazarlo con el promotor deseado para el dispositivo.
3. Después de la minipreparación del plásmido, guarde el ADN en el congelador hasta que esté listo para la digestión.

2. Digestión enzimática de restricción

1. Configure la siguiente reacción en un tubo de microcentrífuga para la digestión EcoRI y NheI: 10 μL de ADN plasmídico J10060 (aislado en el paso 1), 8 μL de agua y 1 μL de enzimas EcoRI y NheI premezcladas con 1 μL de tampón (consulte la Tabla de materiales).
2. Para el ADN promotor, configure la siguiente reacción en un tubo de microcentrífuga para la digestión EcoRI y NheI: 10 μL de secuencias de ADN promotor recocido (8 μL de agua y 1 μL de enzimas EcoRI y NheI premezcladas con 1 μL de tampón.
   1. Para antimonio (Sb-), plomo (Pb-) o trinitrotolueno (TNT)-RFP (ver Tabla de materiales), disuelva los oligonucleótidos en tampón (ácido 30 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES), pH 7,5; acetato de potasio 100 mM), incube en concentraciones molares iguales, caliente a 94 ° C durante 2 min y enfríe gradualmente a temperatura ambiente).
3. Mezcle las muestras pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con la pipeta ajustada a 10 μl.
4. Incubar durante 30 min a 37 °C.
5. Inactivar las enzimas con calor a 80 °C durante 5 min.
6. Guarde el ADN digerido en el congelador hasta que esté listo para el siguiente paso.

3. Ligadura y transformación

1. Ligadura
   1. Usando el plásmido y el ADN promotor que se digirieron dos veces con EcoRI y NheI en el paso 2, configure la mezcla de reacción que se muestra en la Tabla 1 en un tubo de microcentrífuga sobre hielo; agregue la T4 DNA Ligase al final. NOTA: La Tabla 1 muestra una ligadura utilizando una relación molar de vector 1:3 a insertar para los tamaños de ADN indicados.
   2. Mezcle suavemente la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo y microcentrífuga brevemente.
   3. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
   4. Inactivar por calor a 65 °C durante 10 min.
2. Transformación
   1. Descongele un tubo con 20 μL de células de E. coli competentes DH5-alfa en hielo hasta que desaparezcan los últimos cristales de hielo.
   2. Agregue 5 μL de ADN plasmídico a la mezcla celular. Mueva con cuidado el tubo 4-5 veces para mezclar las células y el ADN.
   3. Coloca la mezcla en hielo durante 2 min.
   4. Choque térmico a exactamente 42 °C durante exactamente 30 s. No mezclar.
   5. Coloque en hielo durante 2 min. No mezclar.
   6. Pipetear 380 μL de caldo súper óptimo a temperatura ambiente con represión de catabolitos (SOC) en la mezcla. Extender inmediatamente sobre una placa de agar LB que contenga ampicilina (100 μg/mL) e incubar durante la noche a 37 °C.
   7. Revise las placas dentro de las 24 h para ver si crecen.
   8. Selle las placas con una película de sellado y guárdelas en el refrigerador hasta que estén listas para el siguiente paso.

4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de colonias

1. Agregue a un tubo de PCR (configure 4 tubos de reacción) las mezclas de reacción que se muestran en la Tabla 2.
2. Mezcle suavemente las reacciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
3. Con una punta de pipeta amarilla, raspe una colonia (o región muy pequeña) de la E. coli transformada. Transfiera una pasada de esta E. coli a una nueva placa de LB/ampicilina/agar que se haya seccionado y, a continuación, inserte la punta de la pipeta en el tubo de PCR. Agite la punta de la pipeta para mezclar la E. coli con la mezcla de PCR. Repita tres veces más para colonias adicionales. Transfiera los tubos de PCR a una máquina de PCR y comience el termociclado utilizando el programa que se muestra en la Tabla 3.
4. Ejecute la electroforesis en gel usando un gel de agarosa al 2% en TAE 9Tris-Acetate-EDTA) para determinar qué colonias tienen la mejor ligadura en el plásmido y haga crecer esas colonias en una nueva placa.
5. Guarde las placas en el refrigerador hasta que estén listas para la prueba. Prepare un cultivo líquido en caldo Luria con 100 μg/ml de ampicilina añadida para pruebas químicas.

5. Secuenciación de ADN

1. Para cada muestra, agregue 5 μL de plásmido, 4 μL del cebador de secuenciación y 3 μL de agua desionizada.
2. Coloque esta mezcla en un tubo y envíela para la secuenciación del ADN (consulte la Tabla de materiales).
3. Analice los datos de la secuencia de ADN para comparar las secuencias de ADN esperadas y observadas utilizando un software de análisis de secuencia de ADN para asegurarse de que no haya mutación y que los genes se insertaron correctamente.
   NOTA: A continuación se presenta el uso de E. coli como sensor químico.

6. Preparación de cultivos de E. coli

1. Preparar LB con 100 μg/ml de ampicilina para cultivos líquidos.
2. Prepare cultivos líquidos de las bacterias sensoras, las bacterias de control positivo* y las bacterias de control negativo**.
   NOTA: *Bacterias de control positivo: E. coli que contiene un plásmido con el gen RFP bajo control de un promotor constitutivo; En este trabajo se utilizó el plásmido E1010 del registro de piezas biológicas estándar utilizadas para biología sintética (ver Tabla de materiales).**Bacterias de control negativo: E. coli que contiene un plásmido con el gen RFP bajo control de un promotor diferente, como el promotor pBad (plásmido J10060 del registro de partes biológicas estándar utilizadas para biología sintética (ver Tabla de materiales) o un plásmido que no tiene el gen RFP.
3. Coloque los cultivos en una incubadora agitadora a 37 °C y 220 rpm durante un mínimo de 8 h, máximo de 18 h. El caldo turbio indica crecimiento bacteriano.

7. Titulación de E. coli para verificar la función del dispositivo

NOTA: Una vez que los sensores se han ajustado para verificar la función, no es necesario repetir este paso. Un control positivo en forma de adición de plomo, antimonio y 2,4-DNT o 1,3-dinitrobenceno (1,3-DNB) puede verificar la función de los dispositivos para cada uso sin necesidad de la titulación completa.

1. Preparar una solución madre del analito o analitos de interés a una concentración de 10 ppm en agua. Si la solubilidad es un problema, use una mezcla 50/50 de agua / metanol.
2. Usando la Tabla 4 como guía, etiquete el número apropiado de tubos de cultivo estériles y coloque 2 ml del caldo cultivado (del paso 6 del protocolo) en cada tubo.
   NOTA: Para determinar un rango analítico general, realice al menos tres niveles diferentes de un analito con las bacterias sensoras, un nivel con el control negativo y un nivel con el control positivo. También debe haber un tubo de cada una de las bacterias que no tenga metal agregado (otro tipo de control negativo). Para determinar con mayor precisión el rango analítico y los límites de detección, utilice un rango más amplio de concentraciones de analitos.
3. Agregue solución madre de analito a los tubos que contienen 2 ml de caldo como se indica en la Tabla 4, coloque las tapas a presión en el tubo de cultivo para que queden sueltas (para permitir el flujo de aire hacia el tubo) y agite el tubo de cultivo.
4. Deje los tapones a presión sin apretar en los tubos de cultivo y colóquelos en una incubadora agitadora a 220 rpm y 37 °C durante al menos 24 h.
5. Retire los tubos de la incubadora, encaje las tapas en los tubos con fuerza y guárdelos en el refrigerador hasta que estén listos para el análisis de fluorescencia.

8. Uso de E. coli como sensor químico para residuos de disparos (GSR)

1. Con una toallita a base de etanol diseñada para eliminar el plomo (consulte la Tabla de materiales), limpie todas las superficies de las manos, incluso entre los dedos. Use una toallita separada para cada mano. Guarde las toallitas en una bolsa sellable debidamente etiquetada hasta su análisis.
2. Para las superficies que se van a analizar, use una toallita a base de alcohol para superficies grandes o un hisopo de algodón humedecido con etanol para superficies pequeñas.
   NOTA: Para demostrar la respuesta de los sensores a GSR, el interior de una carcasa de cartucho calibre .40 gastada se limpió con un hisopo de algodón humedecido con etanol.
3. Con guantes limpios y unas tijeras limpias con alcohol, corte una sección de aproximadamente 1 cm² del centro de la toallita.
4. Coloque la pieza cortada de la toallita para manos o el hisopo de algodón directamente en un tubo de cultivo que contenga 2 ml de bacterias sensoras, asegurándose de que esté sumergido en el caldo.
5. Proceda como se describe anteriormente en los pasos 7.4 a 7.5.

Tabla 1. Mezcla de reacción para ligadura, paso 3.1.1 del protocolo.

COMPONENTE	REACCIÓN DE 20 μL
Tampón de ADN ligasa T4 10X	2 μL
ADN plasmídico (3 kb)	3 μL
ADN del promotor (0.7kb)	10 μL
Agua libre de nucleasas	4 μL
ADN ligasa T4	1 μl

 

 

 

 

 

 

Tabla 2. Mezclas de reacción para PCR de colonias, paso 4.1 del protocolo.

Componente	Reacción de 25 μL
Imprimación directa de 10 μM	0,5 μl
Imprimación inversa de 10 μM	0,5 μl
Una mezcla maestraTaq 2X	12,5 μl
Agua libre de nucleasas	11 μL

 

 

 

 

 

Tabla 3. Parámetros de termociclado de PCR para el paso 4.3 del protocolo.

PASO	TEMP	HORA
Desnaturalización inicial	94 °C	30 s
30 ciclos	94 °C	30 s
	55 °C	45 s
	68 °C	60 s
Extensión final	68 °C	5 minutos
Sostener	4 °C

 

 

 

 

 

 

 

Tabla 4. Experimento general establecido para la valoración de biosensores, paso 7.2 del protocolo.

ID del tubo	Gérmenes	Concentración de solución de analito agregada (ppm)	Metal añadido	Volumen de solución de analito añadido a 2.000 μL de caldo	[analito], ppb
1	PbRFP	10	Pb	2.5	12
2	PbRFP	10	Pb	75	361
3	PbRFP	10	Pb	150	698
4	PbRFP	0	ninguno	0	0
5	RFP neg	10	Pb	10	50
6	RFP pos	10	Pb	10	50

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