Ensayo de enjambre para visualizar la motilidad de la superficie bacteriana

Resumen

Fuente: Morales-Soto, N. et. al., Preparación, obtención de imágenes y cuantificación de ensayos de motilidad de la superficie bacteriana. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra un ensayo de enjambre utilizando bacterias que expresan proteína verde fluorescente para observar la motilidad de la superficie en agar blando. Las imágenes de lapso de tiempo capturan la expansión coordinada y la formación de zarcillos, destacando la motilidad de la superficie bacteriana.

Protocolo

1. Preparación e inoculación de medios de ensayo de enjambre

1. Preparación de medios
   NOTA: La composición del medio descrita a continuación es aplicable a los estudios de formación de zarcillos de Pseudomonas aeruginosa . Consulte las especificaciones de medios en la Tabla 1 para los ensayos de motilidad superficial de Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis y Myxococcus xanthus .
   1. Mezcle 200 ml de medio de enjambre de biorreactor aeróbico fluidizado (FAB) menos sulfato de amonio ((NH4)₂SO₄) (Tabla de materiales), 0,9 g de agar Noble y 0,2 g de Casaminoácidos (Tabla 1) agitando con una barra de agitación magnética. Use volúmenes pequeños (100-300 ml) para mejorar la consistencia entre experimentos.
   2. Autoclave la mezcla de agar / medio de 200 ml utilizando un tiempo de exposición de 22 min, una temperatura de exposición de 121,1 °C y una opción de ventilación rápida. La configuración del autoclave permitirá una esterilización y fusión adecuadas del agar, pero evitará la caramelización del agar.
      NOTA: El agar noble es propenso a la caramelización; La motilidad bacteriana se altera en agar caramelizado.
   3. Inmediatamente después de que finalice el ciclo de esterilización, cierre la tapa de la botella de medios para evitar la pérdida de agua por evaporación. Sin embargo, tenga en cuenta que el tapado hermético puede causar un efecto similar al de "sellado al vacío" en la botella.
   4. Enfríe el medio a 50 °C mientras revuelve a temperatura ambiente (RT) y agregue 2 ml de glucosa estéril 1,2 M. Alternativamente, coloque el medio en una incubadora o baño de agua a 60 ° C hasta que esté listo para usar (hasta 15 horas después) y proceda como se indica. Para evitar la formación de burbujas en el medio, mezcle bien con la barra de agitación magnética; Las burbujas en la superficie del agar evitarán que se produzcan enjambres uniformes.
      NOTA: Para otros ensayos, agregue componentes sensibles al calor que no se pueden esterilizar en autoclave, como nutrientes o colorantes adicionales, en este paso, según sea necesario (p. ej., 8 μl de colorante Invitrogen Syto 63 por 100 ml de agar fundido a la imagen M. xanthus, como se muestra en Resultados representativos, a continuación). La adición de algunos tintes puede afectar el comportamiento de enjambre de referencia, que debe verificarse con un control sin colorante.
   5. En una campana de laboratorio, alícuotas 7,5 ml de medios estériles por placa de Petri de poliestireno de 60 mm de diámetro y mantener las placas en una sola capa (no apiladas). Para una superficie de enjambre más grande, alícuota 25 ml de medio por placa de Petri de 100 mm de diámetro. Es importante llenar los platos en una superficie horizontal uniforme. Use un nivel de ojo de buey para verificar si la superficie está nivelada.
      NOTA: Para los ensayos de P. aeruginosa , el uso de un volumen de medio específico por placa mejorará la consistencia y la reproducibilidad. Para los ensayos de B. subtilis y M. xanthus , el vertido manual produce resultados comparables a las alícuotas de volumen específico.
2. Curado en placa
   1. Para placas pequeñas (60 mm), deje que el medio de agar derretido se cure (tanto en semisólido como en exceso de líquido seco) en la campana sin tapar (es decir, sin tapas) durante 30 min. Las placas más grandes (100 mm) requieren un tiempo de curado más largo (ver Discusión).
      NOTA: Alternativamente, algunos ensayos pueden requerir placas para curar en la mesa durante la noche (20-24 horas) cubiertas (es decir, con las tapas puestas) en una sola capa (Tabla 1). El enjambre es sensible tanto al exceso como a la humedad inadecuada. La humedad, el flujo de aire y la temperatura de cualquier laboratorio pueden requerir una variación en el curado en placa para promover un enjambre óptimo de su bacteria.
   2. Inocular las placas inmediatamente después de que finalice el período de secado. No guarde las placas para su uso posterior.
      1. Realice la "prueba de propagación de tinta" detectando una placa de prueba con una mezcla de 10 μl de tinta china negra impermeable Higgins al 0,50% (vol/vol) e inóculo bacteriano. Si la mezcla de tinta e inóculo se esparce fácilmente (es decir, no retiene la forma de gota) en la superficie del medio, el medio necesitará tiempo adicional para secarse.
         NOTA: Para las especies que son particularmente sensibles a la humedad (por ejemplo, P. aeruginosa), realice una "prueba de propagación de tinta" rápida para determinar si las placas están lo suficientemente secas.
3. Inoculación de ensayo de enjambre
   1. Inocular 6 ml de medios de cultivo de caldo (ver Tabla 1 para más detalles) con una colonia aislada de un cultivo en placa de caldo de lisogenia (LB) fresco (< 5 días si se deja a temperatura ambiente). Incubar los cultivos de caldo durante la noche (≤18 h) a 30 °C o 37 °C con agitación horizontal (240 rpm).
   2. Inocular las placas de enjambre manchando con 1-5 μl de cultivo de caldo durante la noche, o "pinchando" el agar con un palillo de dientes estéril o una aguja de inoculación de alambre.
      NOTA: Preferimos este último método porque disminuye la probabilidad de salpicar el inóculo y evita agregar humedad adicional al área de la superficie del enjambre.
4. Incubación de ensayos de enjambre
   1. Para un ensayo general, incubar placas de ensayo de enjambre a 30 °C o 37 °C (o incluso 42 °C para B. subtilis; Tabla 1), esto es específico de la bacteria. Invierta las placas durante la incubación para que el exceso de humedad se condense en la tapa, no en el agar.
      NOTA: La temperatura puede afectar el fenotipo y la cinética. Para los enjambres de P. aeruginosa , la incubación a 37 °C conduce a un crecimiento y expansión de enjambre más rápidos que la incubación a 30 °C; sin embargo, la morfología de estos enjambres a menudo difiere con este cambio de temperatura.
   2. Para obtener imágenes de lapso de tiempo, incube las placas de enjambre a la temperatura adecuada antes de transferirlas a la estación de imágenes (consulte la Tabla 1 para obtener más detalles).
      NOTA: Esta incubación previa a la obtención de imágenes permite que los enjambres comiencen su desarrollo y se establezcan antes de ser trasladados a un nuevo entorno, que puede o no ser óptimo para la motilidad del enjambre.

2. Imágenes macroscópicas de ensayos de motilidad superficial

1. Para las imágenes de lapso de tiempo, después del período de incubación previo a la obtención de imágenes, coloque las placas de ensayo de enjambre en una placa de imágenes transparente dentro de una estación comercial de imágenes in vivo . Imágenes de hasta seis placas de 60 mm de diámetro o cuatro de 100 mm de diámetro a la vez. Dado que la cámara captura imágenes desde debajo del plano de imagen, invierta las placas para que la trayectoria óptica no se obstruya. Alternativamente, incubar a 30 °C o 37 °C (Tabla 1) durante la duración del experimento y retirar las placas que se van a fotografiar de la incubadora a intervalos de tiempo establecidos.
2. Coloque las tapas de las placas de Petri en posición vertical sobre la contraparte de la placa que contiene el medio inoculado. Llene las tapas de las placas de Petri con agua para evitar un secado excesivo durante la obtención de imágenes y encierre toda la configuración con otra bandeja transparente para mantener la humedad durante todo el experimento.
3. Con el software de imágenes moleculares (MI), ejecute ensayos a temperatura ambiente utilizando la configuración de imágenes descrita en la Tabla 2. Para imágenes de lapso de tiempo, configure un protocolo con los pasos y especificaciones necesarios.

Tabla 1: Especificaciones para la preparación del ensayo de motilidad superficial. Incluye especificaciones de preparación de ensayos de motilidad superficial para P. aeruginosa, B. subtilis y M. xanthus.

	P. aeruginosa	Estudios de formación de zarcillos de P. aeruginosa	B. subtilis	M. xanthus
Medios de cultivo de caldo durante la noche	FAB más 30 mM de glucosa	FAB más 30 mM de glucosa	LB	CTT (medios complejos)
Temperatura de incubación del cultivo de caldo durante la noche	37 °C	37 °C	37 °C	30 h a 30 °C
Medios de enjambre	FAB	FAB menos (NH4)2SO4	2% (peso/vol) LB	CTT
Medios de enjambre: componentes adicionales	12 mM Glucosaa	10% (peso/vol) Casaminoácidos (CAA), 12 mM Glucosaa	N/A	SYTO® 64A
Tipo de agar	Agar, Noble	Agar, Noble	Agar granulado	Agar, Noble Affymetrix
Concentración de agar (peso/vol)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
Tamaño de la placa de enjambre	60 milímetros	60 milímetros	100 milímetros	150 milímetros
Volumen de medios por placa	7,5 ml	7,5 ml	Vertido a mano	Vertido a mano
Método de configuración/secado de medios de enjambre	Capucha; Platos descubiertos	Capucha; Platos descubiertos	Placas de sobremesa cubiertas	Placas de sobremesa cubiertas
Tiempo de ajuste/secado de los medios de enjambre	30 minutos	30 minutos	Noche (20 -24 h)	Noche (20 -24 h)
Temperatura de incubación del ensayo de enjambre	30 o 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
Incubación para imágenes de lapso de tiempo	30 °C durante al menos 4 horas	30 °C durante al menos 4 horas	37 °C durante 2 horas	RT durante 12 horas
Duración de la captura de lapso de tiempo	24 horas	24 horas	10 horas	66 horas
Configuración de lapso de tiempo	1 fotograma/10 min	1 fotograma/10 min	1 fotograma/6 min	1 fotograma/10 min
a Se añade después del autoclave.

 

Tabla 2: Especificación de imágenes. Especificaciones de la estación de imágenes Bruker para imágenes de fluorescencia y luminiscencia roja y verde del crecimiento de la superficie bacteriana.

Señal	Fluorescencia verde	Fluorescencia roja I	Fluorescencia roja II	Luminiscencia
Proteína o colorante	Proteína verde fluorescente (GFP)	Proteína de cereza o tinción ramnolípida roja del Nilo	SYTO® 64	Luciferasa del operón lux
Longitud de onda de excitación (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	Apagado
Longitud de onda de emisión (nm)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	Sin filtro
Tiempo de exposición (seg)	30	60	60	240
F-stop	4.0	4.0	2.5	1.1
Campo de visión (mm)	190	190	140	120
Plano focal (mm)	27.5	27.5	12.2	4
Agrupación (píxeles)	Ninguno	2 x 2	Ninguno	8 x 8

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reagentsa:
Medios mínimos FAB:				Preparar cada ~ 4 semanas. Cubra a 1 L con nanopure H2O.
(NH4)número arábigoENTONCES4	Sigma	Referencia A4418	2 gramos	No se utiliza en estudios de formación de zarcillos de P. aeruginosa .
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	9 gramos
KH2PO4	Sigma	P5655	3 gramos
NaCl	BDH	BDH8014	3 gramos
Solución de MgCl2 x 6H2O (198 g/L)	Fisher Scientific	M33	1 ml
CaCl2 x 2H2O solución (14 g/L)	Fisher Scientific	C79	1 ml
Solución de trazas de metales (ver más abajo)	N/A	N/A	1 ml
Solución de trazas metálicas:				Cubra a 1 L con nanopure H2O. Mantener en una botella de vidrio, revolviendo y cubierto con papel de aluminio.
CaSO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 miligramos
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	M7634	20 miligramos
CuSO4 x 5H2O	Fisher Scientific	C493	20 miligramos
ZnSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750	20 miligramos
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	C6768	10 miligramos
NaMoO4 x 2H2O	Sigma	S6646	10 miligramos
H3BO3	Fisher Scientific	A74	5 miligramos
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002	200 miligramos
Medios de comunicación de CTT:				Prepárese según sea necesario. Cubra hasta 100 ml con nanopure H2O.
Tris-HCl, solución 1 M (ajustar a pH 8.0)	Amresco	234	1 ml	Preparar una solución madre de 1 M en nano puro H2O. Ajustar el pH a 8,0 y esterilizar con filtro (poro de 0,2 μm).
K2HPO4, solución de 1 M (ajustar a pH 7,6)	Sigma-Aldrich	P3786	0,1 ml	Preparar una solución madre de 1 M en nano pure H2O. Ajustar el pH a 7,6 y esterilizar con filtro (poro de 0,2 μm).
Solución de MgSO4	Fisher Scientific	M65	0,8 ml	Preparar una solución madre de 1 M en nano pure H2O. Esterilizar con filtro (poro de 0,2 μm).
Casitone	Diagnóstico BD	225930	1 gramo
Reactivos adicionales:
LB Broth, Lennox	Diagnóstico BD	240230	2 % (peso/vol)
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G5767	30 mM para cultivos de caldo durante la noche; 12 mM para medios de enjambre	Prepare una solución madre esterilizada con filtro de 1,2 M en nano puro H2O. Agregue al medio después del autoclave.
Casaminoácidos (CAA)	Amresco	J851	0,10 % (peso/vol)	Recomendado para estudios de formación de zarcillos de P. aeruginosa . Añadir al soporte antes del autoclave.
Agar, Noble	Sigma-Aldrich	A5431	0,45 % (peso/vol)	Agar Noble preferido para estudios de motilidad superficial de P. aeruginosa . Añadir al soporte antes del autoclave.
Agar, Noble	Affymetrix	10907	1,50 % (peso/vol)	Utilizado en estudios de motilidad superficial de M. xanthus . No se recomienda para estudios de motilidad de P. aeruginosa . Añadir al soporte antes del autoclave.
Agar, Granulado	Fisher Scientific	BP1423	0,60 % (peso/vol)
Tinta china negra impermeable Higgins	Higgins	HIG44201	0,50 % (vol/vol)	Mezcle tinta con inóculo para probar la humedad de la superficie del enjambre de medios.
SYTO® 64 tinción de ácido nucleico fluorescente rojo	Invitrogen	S-11346		Utilizar 4 μl (para P. aeruginosa) u 8 μl (para M. xanthus) de SYTO® 64 por 100 ml de agar fundido (añadido después del autoclave).
Materiales y equipos relevantes:
Placa de Petri, estéril, 150 mm x 15 mm (diámetro x alto)	VWR	25384-326
Placa de Petri, estéril, 100 mm x 15 mm (diámetro x alto)	VWR	25384-342
Placa de Petri, estéril, 60 mm x 15 mm (diámetro x alto)	VWR	25384-092
In-Vivo Xtream	Bruker			Úselo para la obtención de imágenes macroscópicas de estudios de motilidad superficial. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html