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1. Preparar instrumentos, medios de cultivo, soluciones y placas de Petri
1. Esterilizar los palillos en autoclave en un vaso de precipitados de 50 ml cubierto con papel de aluminio para mantenerlos estériles.
2. Esterilice todos los productos secos que se utilizarán (puntas, palos, cristalería, etc.) en un autoclave.
NOTA: ¡Cautela! Siga todas las instrucciones de seguridad para el modelo de autoclave utilizado. Los autoclaves representan un riesgo de explosiones, quemaduras por vapor y contacto con superficies, materiales y medios calientes.
3. Prepare el agar MS (Harina de soja manitol (SFM)) para cultivar cultivos.
1. Añadir 5 g de harina de soja y 5 g de agar a un matraz de 1 L.
2. Disolver 5 g de manitol en 250 ml de agua del grifo y dispensar en el matraz que contiene la harina de soja y el agar.
3. Añadir un tapón de espuma y papel de aluminio a la abertura del matraz y el autoclave a 121 °C, 15 psi durante al menos 30 min.
CAUTELA: Este medio se desborda fácilmente. Utilice un matraz que pueda contener al menos cuatro veces el volumen real de agar MS que se está esterilizando en autoclave. Se puede usar una olla a presión estándar en lugar de un autoclave con consideraciones de seguridad similares. Alternativamente, se puede usar un horno de microondas para esterilizar medios y materiales si no es posible acceder a un autoclave. Los maestros de secundaria también pueden querer colaborar con colegios o universidades locales para acceder a suministros esterilizados en autoclave.
4. Enfríe los medios hasta que estén lo suficientemente cómodos como para manipularlos. Tenga cuidado de no enfriarlo por mucho tiempo porque el agar se solidifica a temperaturas inferiores a 50 ° C.
5. Vierta el agar MS del matraz en placas de Petri estériles hasta que el fondo de cada placa de Petri esté aproximadamente medio lleno (aproximadamente 25 ml de medios por placa de Petri). Deje que se solidifique antes de usar placas de agar. Guarde las placas de agar en una bolsa de plástico a temperatura ambiente hasta que las necesite.
NOTA: Las placas de agar también se pueden almacenar en un refrigerador, especialmente si se necesitan antibióticos en el medio.
2. Rayar Streptomyces en placas para su propagación
1. Streptomyces de rayas se cuela en placas de agar MS en colonias individuales utilizando un método estándar, como el método de rayas de cuadrantes.
NOTA: Se puede usar un asa de inoculación o palillos de dientes estériles. Opcional: Otros medios se usan comúnmente para las especies de Streptomyces , como R2YE y medios mínimos.
2. Incubar placas a 30 °C.
3. Vuelva a rayar las placas eligiendo una sola colonia cada 4 a 6 días. A medida que las colonias envejecen, se vuelven propensas a mutaciones aleatorias.
3. Comparar y registrar la apariencia visual
1. Tome nota de la morfología de la colonia para cada mutante en comparación con la cepa madre de tipo salvaje después de rayar todas las cepas como en el paso 2. Compare el nuevo aislado con el de una especie bien estudiada, como S. coelicolor o S. venezuelae, al caracterizar nuevas especies de Streptomyces . Tenga en cuenta las características (Figura 1) como la forma básica, la superficie de la colonia (borrosa, calva, arrugada, etc.), la opacidad, la elevación y la pigmentación (distinga entre micelio vegetativo, micelio aéreo y / o medio circundante).
2. Etiquete una placa de agar MS y raye cepas mutantes y de tipo salvaje en patrones de cuña (Figura 1). Tenga cuidado de que ninguna cepa toque otra cepa para evitar la contaminación cruzada. Tenga en cuenta la fecha y la hora en que las cepas se rayan en la placa. Incubar las placas a 30 °C.
3. Coloque placas de Petri cultivadas sobre papel de color o blanco para homogeneizar el fondo. Escriba en el papel el nombre de la cepa, la fecha, la temperatura de incubación y el tiempo desde la primera raya de la placa. Tome una (s) foto (s) digital (s) de la placa con la última información escrita en el fondo de papel para minimizar la confusión.
NOTA: La escritura se puede recortar de la fotografía en un momento posterior si se va a utilizar para la preparación de figuras.
