Microscopía de contraste de fase para evaluar mutantes del desarrollo en Streptomyces

Abstract

Fuente: Bennett, J. A. et al. Evaluación visual y microscópica de mutantes del desarrollo de Streptomyces . J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra el uso de la microscopía de contraste de fase para examinar las diferencias fenotípicas entre Streptomyces coelicolor de tipo salvaje y mutante. Describe los pasos involucrados en la preparación y obtención de imágenes de filamentos aéreos para detectar defectos de desarrollo en la formación de esporas.

Protocol

1. Realizar microscopía de contraste de fase

1. Esterilice las pinzas lavándolas con etanol al 70% y luego pasándolas por la llama de un mechero Bunsen para evaporar el etanol. Deje enfriar.
2. Esterilice los cubreobjetos lavándolos con etanol al 70% y luego dejándolos secar en una placa de Petri estéril.
3. Prepare un levantamiento de cubreobjetos del crecimiento bacteriano que se va a examinar.
   1. Recoja un cubreobjetos estéril con pinzas estériles y colóquelo en una placa de agar de manitol y harina de soja (MS) donde el crecimiento bacteriano de Streptomyces coelicolor es denso. Presione suavemente la parte posterior del cubreobjetos con unas pinzas para asegurar una transferencia suficiente de esporas bacterianas y micelio aéreo.
4. Levante el cubreobjetos de la placa y colóquelo de modo que el lado con el material celular quede orientado hacia la superficie de un portaobjetos de microscopio, con una gota de 15 μL de glicerol al 50% preparado en agua para el montaje. Reduzca las burbujas de aire colocando el cubreobjetos en un ángulo de 45° con respecto al portaobjetos y dejándolo caer sobre el glicerol al 50%.
5. (Opcional) Selle con esmalte de uñas transparente para preservar el portaobjetos.
6. Realice microscopía de contraste de fase en varios intervalos de tiempo durante los ciclos de vida.
   NOTA: Las imágenes repetidas permiten un análisis más completo y la capacidad de detectar retrasos en el desarrollo. Repita las observaciones de forma independiente para garantizar la precisión y la reproducibilidad.
   1. Coloque el portaobjetos preparado en la platina del microscopio y agregue una gota de aceite de inmersión en el centro del cubreobjetos. Gire el objetivo de fase 100X en su lugar y coloque la torreta del condensador en la configuración de fase adecuada de "coincidencia". Enfoque la imagen usando solo la perilla de ajuste fino una vez que la lente del objetivo esté en contacto con el aceite.
   2. Examine varios campos de visión para discernir diferencias notables y consistentes entre las cepas mutantes y el tipo salvaje, como la capacidad de formar esporas, el tamaño y la forma de las esporas y el número total de esporas (consulte la Figura 1).
      NOTA: Las alternativas a la microscopía de contraste de fase incluyen la microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) y técnicas de tinción simples para su uso con microscopios de campo claro, como la tinción de cristal violeta.

Results

Figura 1: Micrografías de contraste de fase que muestran un filamento aéreo representativo para cepas mutantes blancas de Streptomyces coelicolor que contienen mutaciones aleatorias de inserción de transposones....

Materials