Establecimiento de un cultivo binario de sacaribacterias con bacterias huésped

Resumen

Fuente: Collins, A. J., et al., Establecimiento de cultivos binarios estables de sacaribacterias simbióticas de la cavidad oral. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra el establecimiento y mantenimiento de un cultivo binario de Saccharibacteria y su bacteria huésped mediante la coincubación secuencial en un medio de crecimiento específico del huésped.

Protocolo

1. Concentre las células de Saccharibacteria por centrifugación
   1. Haga una marca de orientación en el tubo y la tapa, y coloque el tubo en una centrífuga de alta velocidad con la marca en la parte superior. El pellet formado por centrifugación suele ser invisible. El marcado ayudará a determinar dónde se encuentra el gránulo de células de Saccharibacteria cuando se realiza la centrifugación y se retira el tubo de la centrífuga.
   2. Centrifugar las muestras a 60.000 x g durante 1 h a 4 °C.
      NOTA: Esta fuerza y tiempo son suficientes para granular todas las células de Saccharibacteria. Sin embargo, las células de Saccharibacteria se pueden granular al menos parcialmente centrifugando durante tan solo 20 min a 20,000 x g.
   3. Retire con cuidado los tubos de la centrífuga. Vierta el líquido del tubo, manteniendo el gránulo en la parte superior del tubo.
   4. Vuelva a suspender el sedimento generalmente invisible en 1-2 ml de tampón MRD (diluyente de recuperación máxima) mediante un vórtice vigoroso.

2. Infectar cultivos huéspedes con filtrado enriquecido con Saccharibacteria

1. Prepare los tubos de cultivo alícuotas 2 ml de medios de crecimiento apropiados (p. ej., TSBY (caldo de soja tríptico con extracto de levadura al 0,1%), BHI (infusión cerebral y cardíaca), etc.) en tubos.
2. Agregue 200 μL del cultivo nocturno de organismos huéspedes a cada tubo. Agregue 100-200 μL de muestra filtrada resuspendida a cada tubo.
3. Incubar muestras combinadas según corresponda para el organismo huésped (por ejemplo, 37 °C, en una atmósfera aeróbica para Arachnia propionica).
4. Pasar las células cada dos o tres días transfiriendo 200 μL de cultivo binario a 2 mL de medio de crecimiento fresco en un nuevo tubo. Si parece que los cultivos pasados no muestran crecimiento (es decir, la turbidez / densidad óptica del cultivo no aumenta después del paso a medios frescos), las Sacaribacterias podrían estar abrumando o matando a todos los organismos huéspedes. Para remediar esto, agregue 200 μL de cultivo de huésped no infectado al pasar las células. Repita durante al menos 5 pasajes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo de infusión Brain Heart (polvo deshidratado)	Becton-Dickinson	211059	U otros medios de crecimiento adecuados para los organismos objetivo
Rotor de centrífuga 70-Ti	Beckman Coulter	337922
2 Guantera InVitro de control	Oraciones tímidas	31615	Si es necesario para organismos microaeróbicos
Centrífuga de alta velocidad Optima L-100 XP	Beckman Coulter	8043-30-1124
Micropipeta P-1000	Gilson	F123601G
Micropipeta P-200	Gilson	F123602G
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Fisher Scientific	BP399500
Peptona	Fisher Scientific	BP1420-500
Puntas de pipeta - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
Puntas de pipeta - 200 μL	Fisher Scientific	02-717-165
Tubos de centrífuga cónicos con tapón de rosca 15 mL	Halcón	352096	U otro tubo adecuado para cultivo bacteriano
Tubos de centrífuga de policarbonato de pared gruesa de 25 x 89 mm (26,3 ml de capacidad) con tapones	Beckman Coulter	355618
Placas de agar de sangre de soja tríptica	Servicios de laboratorio del noreste	P1100	U otra placa de agar suficiente para el crecimiento de organismos hospedadores
Caldo de soja tríptico (polvo deshidratado)	Becton-Dickinson	211825	U otros medios de crecimiento adecuados para los organismos objetivo
Extracto de levadura	Fisher Scientific	BP1422-500