Subcultivo de bacterias anaeróbicas reductoras de sulfito de un cultivo en agar

Resumen

Fuente: Anwar, Z., et al. Enriquecimiento y detección de toxinotipos de Clostridium perfringens en muestras de alimentos al por menor. J. Vis. Exp. (2019).

En este video, las bacterias reductoras de sulfito se cultivan en un medio de agar que contiene sulfito, donde crecen anaeróbicamente y reducen el sulfito a sulfuro de hidrógeno, formando precipitados negros con iones de hierro. Las colonias negras se aíslan de la profundidad del agar utilizando técnicas asépticas y se transfieren a un medio fresco para una incubación anaeróbica continua.

Protocolo

NOTA: Clostridium perfringens se considera un organismo de nivel 2 de peligro para la bioseguridad (BSL2). Aunque no todas las muestras de alimentos contendrán C. perfringens, todas las muestras cultivadas deben tratarse como tales. Se deben usar todas las precauciones adecuadas y equipo de protección personal (EPP) en todo momento. Descontamine todo el material antes de desecharlo.

1. Preparar RPM modificado (medio de perfringens rápido)

1. Combine 30 g/L de medio tioglicolato líquido, 60 g/L de gelatina, 5 g/L de peptona, 5 g/L de glucosa, 5 g/L de fosfato potásico dibásico, 3 g/L de extracto de levadura, 1,5 g/L de cloruro sódico, 0,5 g/L de sulfato ferroso en agua desionizada hasta que se disperse uniformemente. Por lo general, hacemos lotes de 1 L.
2. Autoclave a 121 °C durante 15 min.
3. Dejar enfriar a unos 40 °C.
4. Una vez que las RPM estén frías, agregue D-cicloserina a una concentración final de 440 mg / L.
   NOTA: Las concentraciones de D-cicloserina disueltas en agua estéril a 50 mg/ml pueden almacenarse a -20 °C para su uso futuro.
5. Transfiera asépticamente 10 ml de RPM a tubos cónicos de 15 ml. Las RPM se pueden preparar en lotes y almacenar a 4 °C hasta por un mes.
6. Caliente las RPM a 37 °C antes de su uso.

2. Recogida de muestras e incubación de RPM

1. Transporte los alimentos al laboratorio a temperatura ambiente en 1 h. Los alimentos pueden transportarse en envases originales o estériles. Si no se prueban inmediatamente, los alimentos pueden almacenarse a -20 °C hasta su uso. Si está disponible, anote el tipo de alimento y el país de origen según la etiqueta del envase, así como cualquier otra información relevante.
2. Retire aproximadamente 1,0-2,0 g de comida y transfiérala a una placa de Petri estéril o equivalente. Pica finamente con una cuchilla de afeitar estéril o un bisturí.
3. Inocular en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un tubo cónico de 15 ml. Mezclar bien.
   1. Para seleccionar las células vegetativas, transfiera 5 ml de la mezcla de PBS y alimentos a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de RPM. Asegure bien la tapa.
   2. Para seleccionar las esporas, caliente los 5 ml restantes de la mezcla de PBS y alimentos a 85 ° C durante 15 min y luego transfiéralos a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de RPM. Asegure bien la tapa.
4. Agite e invierta los cultivos de RPM de alimentos para garantizar una mezcla completa.
5. Selle herméticamente los tubos cónicos y envuelva las tapas con una película de parafina o una envoltura de plástico para garantizar un ambiente anaeróbico.
6. Incubar durante la noche (ON) a 37 °C.
7. A la mañana siguiente, observe cualquier turbidez o fermentación en los tubos RPM.

3. Recubrimiento "sándwich" de TSC (cicloserina de sulfito de triptosa)

1. Inocular cultivos ON RPM en agar TSC utilizando una técnica "sándwich" (Figura 1) que se describe a continuación.
2. Prepare el agar TSC según las instrucciones del fabricante.
   1. Prepare la capa base de las placas de TSC transfiriendo 10 ml de agar TSC fundido a placas de Petri estériles y deje que se solidifiquen. Estos pueden prepararse con anticipación y almacenarse a 4 ° C. Asegúrese de que las placas se calienten a temperatura ambiente antes de su uso.
   2. Para la capa superior de la placa TSC, mantener el agar TSC fundido restante a 40 °C.
      NOTA: Aunque el punto de fusión del agar es superior a 85 °C, el agar fundido se solidifica alrededor de 32-45 °C.
3. Recupere cuidadosamente los cultivos ON RPM y transfiera 100 μL a la base de agar TSC. Debido a la fermentación, algunos cultivos pueden estar bajo presión. Asegúrese de usar todo el EPP apropiado.
4. Extienda el inóculo de RPM con perlas de vidrio esterilizadas o esparcidor de células.
5. Deje que las RPM se "absorban" en el agar TSC durante 5-10 min a temperatura ambiente.
6. Transfiera cuidadosamente 20 ml de agar TSC fundido a 40 °C a la placa con una pipeta serológica.
7. Vuelva a colocar la tapa de la placa de Petri y deje que el agar TSC se solidifique completamente a temperatura ambiente.
8. Invierta la placa de Petri e incube a 37 °C ON.
9. Si se desean diluciones en serie, realice diluciones de los cultivos ON RPM en RPM frescas y precalentadas antes de la inoculación en agar TSC.

4. Subcultivo de colonias reductoras de sulfito

1. A la mañana siguiente, retire las placas de la incubadora y examine el crecimiento bacteriano. Las bacterias aeróbicas pueden estar presentes en la superficie del agar. Se encontrarán bacterias anaeróbicas creciendo incrustadas dentro del agar. Las bacterias reductoras de sulfito volverán negro el agar circundante. Las posibles colonias de C. perfringens serán negras e incrustadas en el agar.
2. Las colonias sospechosas de C. perfringens serán positivas para la reducción de sulfito y aparecerán negras, incrustadas dentro del agar. Con un gotero estéril de un solo uso, "arranque" las colonias negras del agar y transfiéralas a 10 ml de RPM frescas en un tubo cónico de 15 ml. Es importante que el aire del gotero sea expulsado antes de perforar el agar.
3. Si hay una cantidad densa de crecimiento bacteriano aeróbico en la superficie de la placa, use un raspador de células estériles para eliminar las colonias de áreas seleccionadas. Se pueden muestrear múltiples colonias sospechosas de C. perfringens de la misma placa de TSC en cultivos separados de RPM.
4. Asegure bien las tapas de los tubos cónicos y envuélvalas en una película de parafina o una envoltura de plástico. Incubar a 37 °C.

Resultados

Figura 1: Esquema de la técnica de sándwich de agar TSC.

Los medios RPM que contienen la bacteria C. perfringens se siembran entre dos capas de agar TSC para promover un ambiente anaeróbico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
D-cicloserina	Sigma-Aldrich	C6880
Dextrosa	Sigma Ciencias de la Vida	D9434-250G
Pipetas de transferencia desechables	cualquier marca		Seleccione uno con punta delgada como las pipetas de transferencia desechables Thermo Scientific 137116M/EMD
Kits de sangre y tejido DNeasy	Qiagen	69504	Nota: se evaluaron numerosos kits de extracciones de ADN y plásmidos, este kit dio los resultados más deseables.
Incubadora seca	cualquier marca
Medio tioglicolato líquido	Remel	R453452
Gelatina de piel de cerdo	Sigma Ciencias de la Vida	G1890-500G
Sulfato de hierro (II) heptahidratado	Sigma Ciencias de la Vida	F8633-250 G
Lisozima de clara de huevo de gallina	Sigma-Aldrich	L6876	Necesario para la extracción de ADN, no incluido en el kit
Parafilm o envoltura de plástico	cualquier marca
Peptona de caseína y otras proteínas animales	Sigma-Aldrich	70173-100G
Perfringens Agar Base (TSC + SFP)	Oxoide	CM0587	Hacer agar TSC de acuerdo con las instrucciones
Fosfato de potasio dibásico	Sigma-Aldrich	P2222-100G
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S-7653
Raspador de células estériles	cualquier marca
Esparcidor de células estériles	cualquier marca
Placas de Petri estériles	cualquier marca
Extracto de levadura	Sigma-Aldrich	70161-100G