Separación basada en cromatografía de capa fina de nucleótidos (p)ppGpp aislados de bacterias inducidas por estrés

1. Cromatografía de capa fina
   1. Con un lápiz suave, marque una línea de origen a 1 cm del borde de la placa de cromatografía en capa fina (TLC) de polietilenimina-celulosa (PEI-celulosa) de 20 cm x 20 cm a la que se le han quitado 5 cm de la parte superior con unas tijeras. Aplicar 5 μL en forma de gota sobre la superficie del PEI para cada muestra. Comience el desarrollo ascendente sin permitir que este punto se seque, lo que mejora la resolución al minimizar las rayas.
   2. Realice un desarrollo ascendente en un tanque con una capa de solución de 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,4) lo suficientemente poco profunda como para que el líquido no toque el punto de la muestra de origen. Cubra el tanque con un sello hermético y deje que el líquido ascienda hasta la parte superior de la hoja recortada, 15 cm. Para alcanzar un pH de 3,4 para una solución de 1,5 M KH₂PO₄ , es necesario ajustar el pH añadiendo H₃PO₄.
   3. Retire el cromatograma completamente desarrollado y seque al aire a temperatura ambiente.
   4. Corte y deseche la parte superior (frente de pH) del cromatograma que contiene el ³²P libre en desechos radiactivos. Esta parte está representada en color amarillo en la Figura 1 y se visualiza fácilmente bajo luz ultravioleta. Si se miden solo nucleótidos de (p)ppGpp que migran más lentamente que el trifosfato de guanosina (GTP), se recomienda ejecutar un estándar de GTP visible a los rayos UV y luego cortar y desechar una porción superior más grande (cualquier cosa por encima de GTP, como se muestra en la Figura 1).
   5. Exponga las películas autorradiográficas durante la noche con una pantalla de fósforo.
   6. Revelar la película. Capture y cuantifique la señal de la pantalla de fósforo con un fosfoimagen.
       
2. Cuantificación de (p)ppGpp
   1. Cuantifique las manchas radiactivas con la Imagen J.
      NOTA: La cantidad de (p)ppGpp se puede normalizar a la cantidad total de nucleótidos G observados en cada muestra (Figura 1). Si la cantidad de fondo es homogénea, se puede restar un solo espacio en blanco (cuadro 4 de la Figura 1) para corregir el fondo. G total es la suma de GTP + ppGpp + pppGpp detectados. Esta normalización supone que los niveles de monofosfato de guanosina (GMP) y difosfato de guanosina (GDP) son insignificantes, lo que es cierto para Escherichia coli. La relación entre un nucleótido dado y G total proporciona una forma importante de corregir las variaciones en el volumen de muestra aplicado.

Figura 1: Análisis representativo de TLC. Representación esquemática de los resultados obtenidos después de la autorradiografía y el cribado de fósforo durante la noche con el TLC. Los puntos a medir se muestran en rojo. También se muestra la fórmula para calcular la cantidad fraccionaria de ppGpp. G total se refiere a la cantidad total de GTP + ppGpp + pppGpp detectada en la muestra. La banda amarilla representa el frente de pH visible bajo la luz ultravioleta. Las tijeras indican dónde recomendamos cortar el cromatograma para descartar la mayor parte de la radiactividad. La flecha indica la dirección del flujo durante el desarrollo ascendente con tampón de fosfato de 1,5 M