Cultivo unicelular de bacterias dentro de vesículas gigantes

Resumen

Fuente: Morita, M., et al. Cultivo de células bacterianas a nivel unicelular dentro de vesículas gigantes. J. Vis. Exp. (2019).

Este video demuestra un método para cultivar y observar células bacterianas individuales encapsuladas dentro de vesículas gigantes ancladas a una bicapa lipídica soportada. El sistema permite obtener imágenes estables y a largo plazo de la dinámica de crecimiento de una sola célula en un microambiente confinado y fisiológicamente relevante.

Protocolo

1. Preparación de un sistema de observación de vesículas gigantes (GV) (sistema de cultivo de células bacterianas)

1. Preparación de pequeñas vesículas (SV) para construir una membrana bicapa soportada
   1. Verter 20 μL de la solución de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) y 4 μL de la solución de biotina-PEG-DSPE (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[biotinil(polietilenglicol)-2000) en un tubo de vidrio.
   2. Evapore el disolvente orgánico mediante el flujo de aire para formar una película lipídica y coloque esta muestra en un desecador durante 1 h para evaporar completamente el disolvente orgánico.
   3. Añadir 200 μL de glucosa 200 mM en medio 1x LB (caldo Luria-Bertani) (la solución acuosa exterior de GV) al vial de vidrio.
   4. Envuelva la parte abierta del vial de vidrio con film y soniquételo en un baño ultrasónico (120 W) durante al menos 1 h.
   5. Prepare SV por el método de extrusión utilizando una miniextrusora y una membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 100 nm.
2. Preparación de una cámara artesanal
   1. Taladre un orificio de 7 mm con un punzón hueco en un sello de doble cara (10 mm x 10 mm x 1 mm).
   2. Pegue el sello de doble cara con el orificio en una cubierta de vidrio (30 mm x 40 mm, espesor 0,25-0,35 mm).
3. Preparación de una membrana bicapa soportada en el cubreobjetos en el orificio de la cámara
   1. Añadir 30 μL de la solución SV al orificio de la cámara (preparado en la sección 2.2) e incubar a RT durante 30 min.
   2. Lave suavemente el orificio dos veces con 20 μL de medio 1x LB que contenga 200 mM de glucosa (la solución acuosa externa de GV) mediante pipeteo.
4. Inmovilización de GV en la membrana bicapa soportada en el vidrio de cubierta en el orificio de la cámara
   1. Introducir 10 μL de neutravidina con la solución acuosa externa de GVs (1 mg/mL) en el orificio e incubar a RT durante 15 min.
   2. Lave suavemente el orificio dos veces con 20 μL de medio 1x LB que contenga 200 mM de glucosa (la solución acuosa externa de GV) mediante pipeteo.
   3. Agregue toda la solución que contenga GV en el orificio de la cámara y selle con un cubreobjetos (18 mm x 18 mm, espesor 0,13-0,17 mm) (Figura 1b).
5. Observación microscópica del crecimiento de células bacterianas dentro de GV
   1. Configure un sistema de platina de calentamiento microscópico con un microscopio invertido equipado con una lente de objetivo de apertura numérica (NA) de 40x/0,6 con una larga distancia de trabajo (Figura 1b).
   2. Coloque la cámara en el sistema de etapa de calentamiento microscópico (Figura 1b). Incubar las GV que contienen células bacterianas en la cámara en condiciones estáticas durante 6 h a 37 °C.
   3. Capture y registre imágenes de microscopio del crecimiento de células bacterianas dentro de GV cada 30 minutos mediante el uso de una cámara científica de semiconductores de óxido metálico complementario (sCMOS).

Resultados

Figura 1: El sistema de observación del cultivo de células bacterianas dentro de GV. (a) Los GV se inmovilizan en una membrana soportada a través de la unión de biotina-neutravidina en el vidrio de cobertura. Los GV se incub...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bactotriptona	BD Biociencias	211705
Cloroformo	Productos químicos puros Wako	032-21921
Cubierta de vidrio (18 × 18 mm)	Matsunami Glass Ind.	C018181	espesor 0,13–0,17 mm
Cubierta de vidrio (30 × 40 mm)	Matsunami Glass Ind.	pedido personalizado	espesor 0,25–0,35 mm
Centrífuga de escritorio	Compañía de alta tecnología.	ATT101	Tipo de rotor oscilante
Junta de doble cara (10 × 10 × 1 mm)	Nitoms	T4613
Glucosa	Productos químicos puros Wako	049-31165
Microscopio invertido	Olimpo	IX-73
Metanol	Productos químicos puros Wako	133-16771
Sistema de etapa de calentamiento microscópico	GOLPE TOKAI	TP-110R-100
Aceite mineral	Nacalai Tesque	23334-85
Neutravidina	Thermo Fisher Scientific	31000
Lente del objetivo	Olimpo	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Membranas de policarbonato	Lípidos polares de Avanti	610005
Cámara sCMOS	Andor	Zyla 4.2 plus	Tamaño de poro 100 nm
Cloruro de sodio	Productos químicos puros Wako	191-01665
Sacarosa	Productos químicos puros Wako	196-00015
Baño de ultrasonidos	COMO UNO	ASU-3D
Extracto de levadura	BD Biociencias	212750
Tubo de plástico con tapa de 0,6 ml	Watson	130-806C
Tubo de plástico con tapa de 1,5 ml	Sumitomo Baquelita Co.	MS4265-M
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Lípidos polares de Avanti	850457P
1,2-distearoil-snglycero-3-fosfoetanolamina-N-[biotinil(polietilenglicol)-2000]	Lípidos polares de Avanti	880129P	POPC
			Biotina-PEG-DSPE