Investigación de la respuesta bacteriana al etileno utilizando un compuesto liberador de etileno

En este artículo

Resumen

Fuente: Augimeri, R. V. et. al., Utilización del compuesto liberador de etileno, ácido 2-cloroetilfosfónico, como herramienta para estudiar la respuesta del etileno en bacterias. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra el efecto del etileno generado por el ácido 2-cloroetilfosfónico (CEPA) en el crecimiento bacteriano y la producción de celulosa. El etileno activa las vías de señalización que estimulan la síntesis de celulosa, lo que resulta en una mayor formación de películas. Estos resultados resaltan la respuesta bacteriana al etileno.

Protocolo

Ensayos de película
1. Cultivar y cuantificar cultivos iniciadores de Komagataeibacter xylinus en triplicado:
  1. Por triplicado, inocular una sola colonia de Komagataeibacter xylinus en 5 ml de medio Schramm y Hestrin (SH) (pH 5) suplementado con celulasa esterilizada por filtro al 0,2% (v/v). Incubar cultivos a 30 °C con agitación a 150 rpm hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm (DO₆₀₀) de 0,3 a 0,4 (aproximadamente 72 h).
  2. Coseche los cultivos iniciadores por centrifugación (2.000 x g; 4 °C; 10 min). Lave las células dos veces con 5 ml de solución salina estéril y vuelva a suspender el gránulo celular. Mantenga las celdas en hielo.
  3. Cuantifique las células utilizando una cámara de recuento Petroff-Hausser.
2. Prepare mezclas maestras para inocular placas de 24 pocillos:
  1. Complementar 60 ml de medio SH (pH 7) con 120 μl de las reservas de ácido 2-cloroetilfosfónico (CEPA) 5, 50 y 500 mM para obtener concentraciones finales de CEPA de 0,01, 0,1 y 1,0 mM, respectivamente. Complementar otros 60 ml de medio SH (pH 7) con 120 μl del disolvente utilizado para disolver la CEPA. Vórtice para mezclar.
  2. Divida cada 60 ml de medio que contenga CEPA en cuatro alícuotas de 14 ml. Inocular tres de las alícuotas de 14 ml con réplicas biológicas del cultivo iniciador a una concentración de 10⁵ células/ml. Mantenga los tubos con celdas en hielo para evitar la producción de celulosa.
    NOTA: Los 14 ml restantes de alícuota se utilizarán para pocillos de control estériles.
3. Inocular placas de 24 pocillos:
  1. Pruebe cada tratamiento en su propia placa con tres filas de réplicas biológicas y una fila de controles estériles (Figura 1).
  2. Usando la mezcla maestra de 14 ml, agregue 2 ml en cada uno de los seis pocillos de una placa estéril de 24 pocillos. Completo para las tres réplicas biológicas y control estéril (Figura 1). Repita para cada tratamiento.
  3. Sellar las placas con film de parafina e incubar estáticamente durante 7 días a 30 °C.
  4. Cosecha y mide el peso seco de la película (rendimiento de celulosa) (Figura 1):
    1. Transfiera individualmente las películas a los pocillos de una placa de 6 pocillos. Para lisar las células, tratar las películas con 12 ml de hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 N a 80 °C durante 20 min.
    2. Retire el NaOH y neutralice las películas lavándolas con agua ultrapura durante 24 horas con agitación. Cambie el agua cada 6 horas.
      NOTA: Las películas deben ser blancas al finalizar el paso de lavado.
    3. Coloque las pesas de película sobre esteras de silicona y séquelas a 50 °C durante 48 horas hasta obtener un peso constante. Una vez secos, retírelos de las esteras y mida su peso en una báscula analítica para determinar el rendimiento de celulosa bacteriana.

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Resultados

Figura 1: Diagrama de flujo que ilustra el protocolo utilizado para el ensayo y análisis de películas. El medio de pH 7 SH suplementado con CEPA (60 ml) se alícuota para tres inoculaciones biológicas replicadas separadas y un control estéril (14 ml cada una). Estos cultiv...