Aislamiento de bacterias gramnegativas con inserciones de transposones genómicos

En este artículo

Resumen

Fuente: Kazi, M. I., et. al., Generación de bibliotecas de inserción de transposones en bacterias gramnegativas para secuenciación de alto rendimiento. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la selección, cuantificación y preservación de bacterias receptoras Gram-negativas portadoras de inserciones de transposones basadas en la resistencia a la kanamicina.

Protocolo

Generación de la biblioteca mutante bacteriana final

Descongele una alícuota del apareamiento congelado en hielo.
Apareamiento de placas en placas de agar Luria-Bertani (LB) de 150 mm complementadas con kanamicina basada en unidades formadoras de colonias (UFC) calculadas en el paso 3.1. Ajuste el volumen con LB para producir 13.333 colonias por 150 μL antes de la siembra.
NOTA: Se determinó que el recuento de UFC aquí era de aproximadamente 10⁵ UFC / ml, por lo que el volumen de apareamiento se ajustó para obtener 13,333 colonias por placa. Esto proporcionaría un número óptimo de colonias en 30 placas para una biblioteca mutante de alta resolución sin abarrotar las placas.
Utilice perlas de vidrio estériles para esparcir 150 μL de la dilución por placa en placas de agar Luria-Bertani de 30 x 150 mm complementadas con kanamicina para obtener 400.000 colonias (Figura 1C).
NOTA: Se pueden usar varillas estériles o cualquier tipo de herramienta esparcidora estéril (es decir, perlas de vidrio) para propagar las bacterias en las placas.
Deseche el tubo usado que contiene exceso de apareamiento.
NOTA: Los ciclos de congelación / descongelación agregan presiones selectivas sobre el cultivo bacteriano, lo que puede sesgar los resultados del experimento Tn-seq. Use una alícuota fresca cada vez.
Incubar las placas a 37 °C durante 14 h.
NOTA: El tiempo de incubación se optimiza para evitar el crecimiento excesivo (colonias que se tocan). Se sugiere minimizar el crecimiento reduciendo el tiempo de incubación.

Estimación de la densidad de bibliotecas y agrupación para el almacenamiento

Cuente las UFC en cada placa para estimar el total de mutantes en la biblioteca de transposones. Cuente el 20% de al menos 3 placas para determinar la estimación del recuento de colonias para todo el grupo de placas (Figura 2A). Asegúrese de que las colonias no toquen otra colonia.
Después de calcular el rendimiento estimado de la colonia, agregue 3-5 ml de LB (o más si es necesario) a cada placa y raspe las bacterias con una herramienta de raspado estéril. NOTA: Se utilizaron asas de inoculación estériles para raspar las placas de manera eficiente.
Agrupe las suspensiones bacterianas de todas las placas en tubos cónicos de 50 ml (Figura 1D). Esto requerirá múltiples tubos cónicos de 50 ml, al menos 3.
Pellet en suspensión bacteriana combinada mediante centrifugación a 5.000 x g durante 7 min.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 5 ml de LB suplementado con glicerol al 30%.
Alícuota 1 ml de la biblioteca de transposones en crioviales y almacenar a -80 °C.

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Resultados

Figura 1: Esquema de la construcción de la biblioteca mutante de transposones. (A) Conjugación bacteriana. La cepa "donante", que codifica la maquinaria de transposición, se mezcló con la cepa "receptora". La mezcla se detectó en placas de agar...