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1. Transformación natural
NOTA: El derivado N315, N2-2.1 se utilizó como receptor. En esta cepa, el locus sigH se duplicó para expresar constitutivamente SigH. Si el marcador de resistencia a transferir no es cloranfenicol, se puede usar pRIT-sigH (CmR) para expresar SigH. El plásmido purificado o el extracto de ADN completo de S. aureus COL-45 adquirido por cfr se utiliza como ADN donante para la transformación.
- Preparación del ADN del donante
- Cultivar COL-45 durante la noche agitando a 37 °C en un matraz de 300 ml que contenga 50 ml de caldo de soja tríptico (TSB) suplementado con 32 mg/L de cloranfenicol. Cultivo de E. coli HST04 que lleva el plásmido pHY300 (TetR) para extraer el plásmido para el experimento de control.
NOTA: HST04 (dam-/dcm-) carece de los genes de la metilasa del ADN. También se pueden usar otras cepas convencionales con metilasas de ADN para preparar el donante de ADN, porque el estado de metilación del ADN no afecta la eficiencia de transformación. Alternativamente, el plásmido pT181 purificado de la cepa de S. aureus COL también se puede utilizar como control positivo para el ensayo de transformación. - Recoger las células por centrifugación (8.000 x g durante 10 min a 4 °C).
- Extraiga los plásmidos utilizando un kit de extracción de ADN plasmídico o un método convencional de purificación de ADN para purificar todo el ADN.
- Cuantificar el ADN purificado mediante un espectrómetro y mantenerlo a 4 °C hasta su uso.
NOTA: Use una preparación de ADN fresca para el ensayo de transformación, generalmente de menos de una semana de edad. Las preparaciones de ADN antiguas reducen la eficiencia de la transformación.
- Ensayo de transformación
- Cultivar la célula receptora (N2-2.1) durante la noche en 5 ml de TSB a 37 °C con agitación.
- Transfiera 0,5 ml del cultivo nocturno a un tubo de 1,5 ml. Precipitar las células por centrifugación (10.000 x g durante 1 min a 4 °C).
- Suspender las células con 10 mL de medio CS2 en un tubo de 50 ml.
NOTA: El medio CS2 es un medio sintético completo que induce la competencia para la transformación natural en S. aureus. Otros medios de laboratorio estándar, como TSB o infusión cerebro-corazón (BHI), no son adecuados para la transformación. - Cultive las bacterias a 37 ° C agitando (180 rpm) hasta la fase exponencial tardía (aproximadamente 8 horas).
- Cosechar las células por centrifugación (5.000 x g durante 5 min a 4 °C).
- Vuelva a suspender las células en 10 ml de medio CS2 fresco.
- Agregue 10 μg de plásmido purificado o ADN del genoma (paso 1.1.4) a la suspensión celular. Agitar a 37 °C y 180 rpm durante 2,5 horas.
NOTA: Los tiempos de incubación más cortos con ADN (<2,5 h) dan como resultado frecuencias de transformación más bajas. - Recoger las células por centrifugación (5.000 x g durante 5 min a 4 °C).
- Vuelva a suspender las células en 10 ml de medio BHI. Mezclar la suspensión celular con 90 ml de suplemento de agar BHI derretido (55 °C) con 32 mg/L de cloranfenicol (o 5 mg/L de tetraciclina en el experimento de control). Vierta la mezcla en las placas de Petri de 90 mm. Enfriar rápidamente y dejar que el agar se solidifique.
- Incubar las placas a 37 °C durante 2 días.
- Replicar las colonias generadas (transformantes) transfiriendo las colonias (usando palillos de dientes) a nuevas placas de agar BHI que contienen los antibióticos apropiados para confirmar sus características de resistencia. Confirmar el gen de resistencia adquirido (cfr o tetM) mediante PCR de colonias.