Evaluación de la mortalidad inducida por bacterias patógenas en larvas de C. elegans

Resumen

Fuente: Anderson, Q. L., et al. Un patosistema de C. elegans de alto rendimiento, alto contenido y base líquida. J. Vis. Exp. (2018)

El video demuestra un ensayo a base de líquido donde las larvas de C. elegans modificadas genéticamente se exponen a bacterias patógenas en una microplaca. Las toxinas bacterianas secretadas en el medio inducen el estrés y la muerte del huésped. Un tinte fluorescente tiñe los gusanos muertos, lo que permite la cuantificación de la mortalidad basada en imágenes para evaluar la susceptibilidad o resistencia genética.

Protocolo

1. Configuración del ensayo de eliminación líquida (protocolo básico)

Nota: Este es un protocolo para una cepa bacteriana y una fuente de gusanos.

1. Con un raspador de células, retire la Pseudomonas aeruginosa de una placa de muerte lenta o SK y vuelva a suspender en ~ 5 ml de S basal. Amplíe si es necesario. Medir la densidad óptica de la suspensión bacteriana con un espectrofotómetro (OD₆₀₀)
2. Preparar 24 mL de stock diluido de P. aeruginosa en S Basal a OD₆₀₀ ≈ 0.09 (concentración final 3X). Consulte 4.6.2 para conocer el contenido final por pocillo y escale el volumen de dilución bacteriana en consecuencia.
3. Añadir 21 ml de medios líquidos Slow Kill (3 g de NaCl, 3,5 g de peptona/L suplementados con CaCl₂ y MgSO₄ hasta una concentración final de 1 mM). Con una pipeta multicanal, transfiera 45 μl de bacterias y medios a cada pocillo de una placa de 384 pocillos.
4. Lave los gusanos de su origen en un tubo cónico de 50 ml y permita que los gusanos se asienten bajo la fuerza gravitacional. Aspirar sobrenadante a 5 mL. Resuspender en un total de 50 mL S basales.
5. Repita el paso 1.4 dos veces.
6. Con un clasificador de gusanos, clasifique aproximadamente 22 gusanos en cada pocillo de la placa de 384 pocillos.
   Nota: La configuración deja caer cada gusano en ~1,1 μL de líquido. 22 gusanos equivaldrán a 25 μL, lo que elevará el volumen total del ensayo a 70 μL/pocillo.
   1. La composición final de cada pocillo consta de 70 μL. Se agregan 45 μL de este volumen como medio bacteriano (0,03 OD₆₀₀ bacterias en 24 μL S Basal y 21 μL SK suplementado con CaCl₂ y MgSO₄). Los otros 25 μL se agregan con los 22 gusanos.
   2. Si el clasificador utilizado aquí (consulte la tabla de materiales) no está disponible, los gusanos se pueden diluir a una concentración final de 1 gusano / μL en S Basal y pipetear 25 μL / pocillo con una pipeta multicanal. Sin embargo, los resultados pueden exhibir una mayor variabilidad. Alternativamente, es posible utilizar un dispensador de líquido peristáltico, como lo describen Leung y sus colegas.
7. Después de clasificar los gusanos en la placa de 384 pocillos, selle la placa con una película permeable al gas e incube las placas a 25 ° C durante 24 a 48 h.
8. En el momento deseado, use una lavadora de microplacas para lavar la placa de 384 pocillos con S Basal un total de 5 veces.
   1. Después del segundo lavado, aspire la mayor parte del medio, dejando ~ 20 μL. Agite vigorosamente las placas con un vórtice de microplacas durante al menos 30 segundos para aflojar cualquier residuo del fondo de los pocillos).
9. Después del lavado final, aspire el sobrenadante hasta 20 μL. Agregue 50 μL de tinción de ácido nucleico de 0,98 μM (consulte la Tabla de materiales)/pocillo de la placa de 384 pocillos, para obtener una concentración final de 0,7 μM.
10. Incubar a temperatura ambiente durante 12 - 16 h. Este tinte solo manchará los gusanos muertos. Después del período de incubación deseado, lave las placas con la lavadora de microplacas para eliminar cualquier exceso de mancha (un mínimo de 3 lavados).
11. Para la adquisición de datos, utilice un espectrofotómetro o un microscopio automatizado para obtener imágenes de la luz transmitida y la fluorescencia (excitación de 531 nm y emisión de 593 nm).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
COPAS FP BioSorter	Unión Biométrica		Citómetro de flujo de objetos grandes/clasificador de gusanos
Citación 5	BioTek
EL406 Dispensador de lavadora	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 Bloque RB de pozo profundo	Thermo Fisher Scientific	CS15124
Placa de 384 pocillos	Greiner Bio-One	MPG-781091
Medios de crecimiento de nematodos (NGM)			Cantidad por litro: 18 gramos de agar, 3 gramos de NaCl, 2,5 gramos de peptona, 1 ml de CaCl₂ (1 M), 1 ml de MgSO₄ (1 M), 25 ml de tampón de fospato y 973 ml de agua mili-Q
Placas de muerte lenta (SK)			Cantidad por litro: 18 gramos de agar, 3 gramos de NaCl, 3,5 gramos de peptona, 1 ml de CaCl₂ (1 M), 1 ml de MgSO₄ (1 M), 25 ml de tampón de fosfato y 973 ml de agua mili-Q
Medios de Slow Killing (SK)			Cantidad por litro: 3 gramos de NaCl, 3,5 gramos de peptona, 1 ml de CaCl₂ (1 M), 1 ml de MgSO₄ (1 M), 25 ml de tampón de fosfato y 973 ml de agua mili-Q
Caldo de lisogenia (LB)	USBiología Ciencias de la Vida	L1520
Caldo de infusión Brian Heart (BHI)	Research Products International Corp	50-488-526
Solución de lejía antiparasitaria			Cantidad por 100 ml: 10 ml de solución de NaOH 5 M, 20 ml de solución de hipoclorito de sodio al 5% y 70 ml de agua estéril
S Basal			Cantidad por litro: 5,85 gramos de NaCl, 6 gramos de KH₂PO₄, 1 gramo de K₂HPO₄ y 1 litro de agua mili-Q
Agar-agar	USBiología Ciencias de la Vida	A0930
NaCl	USBiología Ciencias de la Vida	S5000
Peptona	USBiología Ciencias de la Vida	P3300
CaCl₂	USBiología Ciencias de la Vida
MgSO₄	Fisher Scientific	M63-500
Tampón de fosfato			cantidad por litro: 132 ml de K₂HPO₄ (1 M) y 868 ml de KH₂PO₄ (1 M)
KH₂PO₄	Acros Organics	7778-77-0
K₂HPO₄	USBiología Ciencias de la Vida	P5100
Solución de hipoclorito de sodio al 5%	BICCA	7495.5-32
Solución de NaOH	Fisher Scientific	SS255-1
Respira tranquilo	Biotecnología diversificada	BEM-1
SYTOX Tinción de ácido nucleico naranja	Fisher Scientific	S11368
Cepas bacterianas
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis (OG1RF)
Superalimento E. coli (OP50)
E. coli Bacterias que expresan ARNi (HT115)
Cepas de gusanos
glp-4(bn2) (Beanan y Strome, 1992, PMID: 1289064)
Reportero de PINK-1::GFP (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)