Cultivo y mantenimiento de bacterias que expresan ARNi

Resumen

Fuente: Anderson, Q. L., et al., Un patosistema de C. elegans de alto rendimiento, alto contenido y base líquida. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la preparación de bacterias de interferencia de ARN (ARNi) que transportan plásmidos para inhibir la expresión génica diana. Describe los pasos de selección, crecimiento e inducción de bacterias de ARNi para producir placas que expresan dsRNA para ensayos posteriores.

Protocolo

1. Preparación de bacterias de interferencia de ARN (ARNi)

1. Eliminar o transferir las cepas deseadas de bacterias que contienen ARNi a placas de agar de caldo de lisogenia (LB) que contengan antibióticos apropiados (carbenicilina a 100 μg/ml y tetraciclina a 15 μg/ml para las bibliotecas Ahringer y Vidal) de un caldo congelado.
   Nota: Cuando trabaje con bacterias no patógenas, utilice una cabina de seguridad biológica de nivel de bioseguridad (BSL)-2 A/B o una campana de flujo laminar BSL-1 para garantizar la esterilidad de los cultivos y minimizar la posibilidad de contaminación cruzada de la biblioteca.
2. Incubar placas durante 24 h a 37 °C.
3. Almacene las placas a 4 °C hasta por dos semanas.
   1. Después de dos semanas, deseche los platos y reemplácelos con platos recién hechos.
4. Pruebe múltiples cepas de ARNi en paralelo inoculando individualmente una sola colonia de cada clon en 4 ml de LB suplementado con carbenicilina en un solo pocillo de una placa de pocillos profundos de 24 pocillos o en un tubo de ensayo estéril.  
   Nota: Se ha informado que la tetraciclina reduce la eficiencia del ARNi. No lo use en este medio.
5. Coloque placas de pocillos profundos de 24 pocillos en una incubadora de agitación optimizada para placas multipocillos e incube a 37 °C durante 16 h mientras agita a 950 rpm. Nota: Es difícil obtener un crecimiento bacteriano uniforme en placas de pocillos múltiples utilizando una incubadora de agitación convencional. La incubadora de agitación debe poder agitarse a un mínimo de 750 rpm para que los cultivos crezcan correctamente. En ausencia de un agitador especializado, es posible cultivar cada cultivo en un tubo individual. Los cultivos se pueden transferir a la placa de 24 pocillos para centrifugarlos posteriormente.
6. Recolecte bacterias centrifugando durante 5 minutos a 2,000 x g.
7. Decantar el sobrenadante invirtiendo el plato y agitando vigorosamente. Resuspender bacterias de ARNi en 100 μL de S Basal (5,85 g de cloruro de sodio, NaCl; 1 g de fosfato dipotásico, K₂HPO₄; 6 g de fosfato monopotásico, KH₂PO₄ disuelto en 1 L de agua ultrapura y esterilizado en autoclave).
8. Pipetee las bacterias resuspendidas en un número adecuado de pocillos de una placa NGM multipocillo (medios de crecimiento de nematodos, 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 1 mM de cloruro de calcio, CaCl₂; 1 mM de sulfato de magnesio, MgSO₄; 25 mL de tampón de fosfato (cantidad por litro: 132 mL de K₂HPO₄ (1 M) y 868 mL de KH₂PO₄ (1M)), y 18 g de agar por litro de agua) suplementado con IPTG (isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido; concentración final de 1 mM) y carbenicilina (concentración final de 100 μg/mL).
   1. Utilice 3,5 ml de medios NGM por pocillo de una placa de 6 pocillos, 1 ml por pocillo de una placa de 24 pocillos o 150 μl por pocillo de una placa de 96 pocillos.
   2. Use 100 μL / pocillo de bacterias para una placa de 6 pocillos, 50 μL / pocillo para una placa de 24 pocillos o 20 μL / pocillo para una placa de 96 pocillos. Deje secar.
      Nota: El secado se realiza normalmente en una campana de flujo estéril para promover un secado rápido y uniforme. El secado uniforme es muy importante. Evite el secado excesivo, ya que las grietas en el agar promueven la excavación de gusanos. Esto conduce a pérdidas de gusanos y posibles obstrucciones de los sistemas de manejo de líquidos.
9. Utilice las placas preparadas inmediatamente o guárdelas a 4 °C durante un máximo de dos semanas para su uso posterior.
   Nota: Para evitar que los platos se sequen, se pueden sellar con una película de parafina de plástico o colocarlos en un recipiente herméticamente cerrado con toallas de papel húmedas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bloque RB de 24 pozos profundos	Thermo Fisher Scientific	CS15124
Medios de crecimiento de nematodos (NGM)			Cantidad por litro: 18 gramos de agar, 3 gramos de cloruro de sodio, 2,5 gramos de peptona, 1 ml de cloruro de calcio (1 M), 1 ml de sulfato de magnesio (1 M), 25 ml de tampón de fosfato y 973 ml de agua mili-Q
Caldo de lisogenia (LB)	USBiología Ciencias de la Vida	L1520
S Basal			Cantidad por litro: 5,85 gramos de cloruro de sodio, 6 gramos de fosfato monopotásico, 1 gramo de fosfato dipotásico y 1 litro de agua mili-Q
Agar-agar	USBiología Ciencias de la Vida	A0930
Cloruro de sodio	USBiología Ciencias de la Vida	S5000
Peptona	USBiología Ciencias de la Vida	P3300
Cloruro de calcio	USBiología Ciencias de la Vida
Sulfato de magnesio	Fisher Scientific	M63-500
Tampón de fosfato			Cantidad por litro: 132 mL de fosfato dipotásico (1 M) y 868 mL de fosfato monopotásico (1 M)
Fosfato monopotásico	Acros Organics	7778-77-0
Fosfato dipotásico	USBiología Ciencias de la Vida	P5100