Expresión del operón de luminiscencia en bacterias bioluminiscentes marinas

Resumen

Fuente: Brodl, E., et al. In situ Medición y correlación de la densidad celular y la emisión de luz de bacterias bioluminiscentes. J. Vis. Exp. 1 (2018)

Este video demuestra el cultivo de bacterias bioluminiscentes marinas para observar la activación mediada por detección de quórum del operón de luminiscencia, lo que permite el monitoreo en tiempo real de la expresión génica y la emisión de luz para estudios de comunicación microbiana y regulación génica.

Protocolo

1. Expresión de cepas bioluminiscentes bacterianas

NOTA: Las cepas bioluminiscentes bacterianas requieren un medio de crecimiento específico / medio de agua de mar artificial para el crecimiento y la producción de luz.

1. Prepare un medio de agua de mar artificial, compuesto por dos componentes de medio preparados por separado.
   NOTA: Las siguientes cantidades son para 1 L de medio líquido o 1 L de medio agar.
   1. Para el medio artificial de agua de mar, pesar en las siguientes sales: 28,13 g de NaCl (cloruro de sodio), 0,77 g de KCl (cloruro de potasio), 1,60 g de CaCl₂ · 2H₂O (cloruro de calcio dihidratado), 4,80 g de MgCl₂ · 6H₂O (cloruro de magnesio hexahidratado), 0,11 g de NaHCO₃ (bicarbonato de sodio) y 3,50 g de MgSO₄ · 7H₂O (sulfato de magnesio heptahidratado).
   2. Añadir 1 L de agua destilada y disolver todos los componentes.
   3. Para LB (Luria-Bertani) medio, pesar los siguientes ingredientes: 10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona y para placas de agar, 20 g adicionales de agar.
   4. Agregue 250 ml de agua del grifo y disuelva los componentes.
   5. Esterilizar en autoclave ambos medios preparados por separado a 121 °C durante 20 min.
   6. Para placas de agar, combine 250 ml de medio LB con 750 ml de medio de agua de mar artificial directamente después del autoclave y prepare las placas.
   7. Para el medio líquido, combine 250 ml de medio LB con 750 ml de medio de agua de mar artificial, ya sea directamente después del autoclave o cuando se enfríe.
      NOTA: El medio artificial de agua de mar puede volverse turbio a través de la precipitación de sal.
2. Rayar las cepas bioluminiscentes bacterianas en placas de agar de medio de agua de mar artificial e incubar durante la noche a 24 - 30 °C.
   NOTA: El almacenamiento a largo plazo de las cepas bacterianas normalmente se logra mediante la congelación de las existencias de glicerol del cultivo bacteriano. Las cepas siempre deben rayarse primero en las placas de agar para garantizar condiciones de inicio uniformes para todas las cepas, antes de su uso para cultivos líquidos, debido a una fase de retraso en el crecimiento después de la descongelación.
3. Prepare un ONC (cultivo nocturno) inoculando 100 ml de medio de agua de mar artificial con una sola colonia de la placa. Incube el ONC a 24 - 30 °C y 120 rpm en un agitador de incubadora durante la noche.
4. Inocular 800 mL de medio artificial de agua de mar con 8 mL de ONC.
5. Incubar las células bacterianas a 24 - 30 °C y 120 rpm en un agitador de incubadora.
   NOTA: El perfil de intensidad de luz de las bacterias bioluminiscentes varía mucho con la temperatura. Dependiendo de los mecanismos reguladores de la producción de luz de la cepa bacteriana respectiva, la emisión de luz puede comenzar después de aproximadamente 1 a 6 h.
6. Observe el cultivo de células bacterianas hasta que comiencen a brillar (aproximadamente 1 - 6 h).
   NOTA: Dependiendo del propósito de la expresión, las células se cultivan hasta el día siguiente y luego se cosechan, o las células se pueden mantener agitando mientras estén brillando. La recolección de las células y la purificación de cualquier proteína se pueden realizar de acuerdo con los procedimientos estándar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agitador de incubadora estándar Multitron	Infors AG