Análisis microscópico del crecimiento bacteriano bajo estrés utilizando cámaras microfluídicas

Resumen

Fuente: Cayron, J., et al. Análisis multiescala de tratamientos de crecimiento bacteriano bajo estrés. J. Vis. Exp. (2019).

Este video demuestra cómo preparar y usar una placa microfluídica para obtener imágenes de células bacterianas en condiciones de estrés. Describe el proceso de introducción de un cultivo bacteriano y un medio antibiótico que induce estrés, seguido de la carga celular y la configuración microscópica. A continuación, se utilizan imágenes de lapso de tiempo en modo de contraste de fase para observar el desarrollo de células filamentosas alargadas con mayor contenido de ADN debido a la inhibición de la división celular.

Protocolo

1. Imágenes de microscopía de lapso de tiempo de microfluidos
   1. Retire la solución de conservación de la placa microfluídica y reemplácela con medio nuevo precalentado a 37 °C, como se describe en la guía del usuario del software microfluídico.
   2. Selle la placa microfluídica al sistema de colector y haga clic en el botón Cebado.
   3. Coloque la placa microfluídica con el sistema de colector en la platina del microscopio y precaliente a 37 °C durante ~2 h antes de iniciar la adquisición de microscopía.
      NOTA: Este paso de precalentamiento es fundamental para evitar la dilatación de la cámara microfluídica, lo que alteraría el enfoque del microscopio durante el experimento de lapso de tiempo y comprometería la adquisición de imágenes.
   4. Selle la placa microfluídica. Reemplace el medio del pocillo 8 con 150 μL de muestra de cultivo y reemplace el medio del pocillo 1 al 5 por el medio deseado con o sin el reactivo inductor de tensión.
   5. Selle la placa microfluídica y colóquela en la platina del microscopio.
   6. En el software microfluídico ejecute el procedimiento de carga de celdas. Compruebe que la carga de las células es satisfactoria mirando bajo el microscopio en luz transmitida. Ejecute el procedimiento de carga de células por segunda vez si la densidad de células en la cámara es insuficiente.
   7. Realice un enfoque cuidadoso en el modo de luz transmitida y seleccione varios campos de visión que muestren bacterias aisladas. Es importante seleccionar campos que no estén superpoblados para poder monitorear el crecimiento de células aisladas a lo largo del tiempo (se recomienda ~ 10-20 células por 100 μm²). Esto también facilitará la detección de células durante el análisis de imágenes.
   8. En el software microfluídico, haga clic en el botón Crear un protocolo. Programe la inyección de medio de crecimiento para equivalentes de tiempo de 1 a 2 generaciones para permitir que las células se adapten (opcional). Luego programe la inyección del medio inductor de estrés durante 10 min a 2 psi, seguido de la inyección a 1 psi durante la duración deseada del tratamiento de estrés. Si tiene la intención de analizar la recuperación de las células después del estrés, programe la inyección de medio de crecimiento fresco durante el tiempo deseado.
      NOTA: En el experimento presentado aquí, se inyectó cefalexina durante 10 min a 2 psi, seguido de 50 min a 1 psi. Luego, se inyectó medio de crecimiento fresco a 2 psi durante 10 min, seguido de 3 h a 1 psi.
   9. Realice imágenes de microscopía en modo de lapso de tiempo con 1 fotograma cada 10 minutos utilizando contraste de fase en luz transmitida y una fuente de luz de excitación de 560 nm para la señal mCherry si es necesario.
      NOTA: Es importante iniciar la adquisición de imágenes microscópicas al mismo tiempo que el inicio del protocolo de inyección microfluídica.

Materiales