Evaluación del enjambre bacteriano mediante una placa inhibidora de gradiente

Resumen

Fuente: Guo, S., et al. Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductor. J. Vis. Exp. (2022).

Este video demuestra el uso de una placa de enjambre de gradiente de doble capa para estudiar el comportamiento del enjambre bacteriano bajo concentraciones variables de inhibidores. Una placa con un inhibidor formador de gradiente en la capa inferior se inocula con bacterias y se incuba. Las imágenes se capturan a intervalos regulares para analizar el efecto de la concentración de inhibidores en el enjambre bacteriano.

Protocolo

1. Preparación de placas de enjambre de gradiente

1. Preparación del medio de enjambre
   NOTA: En este protocolo se utilizó una concentración de agar del 0,7% (p/v) del medio de enjambre.
   1. Preparar caldo de lisogenia (LB) en polvo con agar en dos matraces cónicos; cada matraz contiene 2 g de triptona, 2 g de cloruro de sodio (NaCl), 1 g de extracto de levadura y 1,4 g de agar. Añadir agua bidestilada (ddH₂O) y agitar la suspensión con una barra de agitación magnética. Ajuste el volumen final a 200 ml agregando ddH₂O adicionales.
   2. Autoclave la solución a 121 °C durante 20 min. Use una tapa permeable al aire o una película de sellado de botellas con una salida de aire.
      NOTA: El agar se disolverá cuando se caliente en el autoclave.
   3. Cuando la temperatura descienda a 65 °C, mezcle la solución para garantizar la homogeneidad y transfiera el medio a una incubadora o baño de agua a 65 °C para uso a corto plazo.
2. Preparación del medio de enjambre de la capa inferior
   NOTA: El medio de la capa inferior es la mezcla de medio de enjambre y soluciones madre inductoras. La formulación de las placas de enjambre de gradiente inductor se muestra en la Tabla 1.
   1. Prepare una solución madre de resveratrol de 100 mM disolviendo 114,12 mg de polvo de resveratrol liofilizado en 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y almacene la solución a -20 °C.
   2. Preparar una solución madre de arabinosa al 20% (p/v) disolviendo 6 g de polvo de arabinosa en 30 ml de ddH₂O; espere de 10 a 15 minutos para permitir que la arabinosa se disuelva; y almacene la solución a temperatura ambiente.
   3. Saque el medio de la incubadora a 65 °C y colóquelo a temperatura ambiente; deje que el medio del enjambre se enfríe hasta que el matraz Erlenmeyer esté lo suficientemente frío como para aguantar (~50 °C). No coloque el medio de enjambre a temperatura ambiente durante períodos prolongados, ya que esto provocará la solidificación del agar.
   4. Añadir el volumen requerido de la solución madre del inductor al medio de enjambre a 50 °C (Tabla 1). Utilice una pipeta para dispensar la solución inductora en lugar de verterla. Agite suavemente para mezclar el inductor con el medio de enjambre.
      NOTA: Este paso es para inductores que no se pueden esterilizar en autoclave. Tenga cuidado de no introducir burbujas en el medio.
3. Preparación de placas de enjambre de gradiente de doble capa
   NOTA: El medio de la capa superior es un medio LB que contiene agar al 0,7% (p/v).
   1. Etiquete placas de Petri cuadradas de 13 x 13 cm con el nombre y las cepas del inductor, y apoye las placas sobre el borde de las tapas (Figura 1B).
   2. Agregue 40 ml de medio de capa inferior tibia (50 °C) con una pipeta de 50 ml o un tubo de centrífuga de 50 ml.
      NOTA: Alternativamente, para placas de Petri cuadradas de 13 x 13 cm, es adecuado un medio de capa inferior y superior de 40 ml; para placas de Petri cuadradas de 10 x 10 cm, es adecuada una capa inferior de 25 ml y una capa superior mediana.
   3. Deje que el medio de la capa inferior se cure sin tapar durante 1 h dentro de una campana de flujo laminar. No moleste las placas de Petri cuadradas mientras el medio se solidifica.
      NOTA: Mientras se cura la capa inferior, el medio de enjambre que no contiene inductores debe mantenerse en una incubadora o baño de agua a 65 °C.
   4. Una vez que la capa inferior esté completamente solidificada, retire las tapas y coloque las placas de Petri cuadradas dentro de una campana de flujo laminar.
   5. Agregue 40 ml de medio de capa superior tibio (50 °C) con una pipeta de 50 ml o un tubo de centrífuga de 50 ml.
      NOTA: El medio de la capa superior no contiene inductores.
   6. Cure las placas de doble capa en la mesa de trabajo, cubiertas y sin tocar durante 1 h. Almacene las placas preparadas a 4 °C durante un máximo de 24 h.NOTA: Tiempos de curado más largos reducirían el contenido de humedad y restringirían la motilidad del enjambre.

2. Crecimiento de E. coli K12 y P. aeruginosa PAO1

1. Prepare 500 ml de medio LB agregando 5 g de triptona, 5 g de NaCl y 2,5 g de extracto de levadura en ddH₂O, y complete la solución a 500 ml. Autoclave la solución en el ciclo líquido durante 20 min a 121 °C y guárdela a 4 °C.
2. Prepare 100 ml de medio de agar LB al 1,5% (p/v) añadiendo 1 g de triptona, 1 g de NaCl, 0,5 g de extracto de levadura y 1,5 g de agar en ddH₂O y rellene la solución a 100 ml. Autoclave la solución en ciclo líquido durante 20 min a 121 °C. Transfiera el medio a un baño de agua a 50 °C para evitar que el agar se solidifique.
3. Cuando el matraz de medio de agar LB sea cómodo de sostener, agregue 20 ml de medio de agar LB en una placa de Petri (10 cm de diámetro) con una pipeta de 25 ml. Deje la placa a temperatura ambiente durante la noche y guarde la placa de agar LB a 4 °C.
4. Tome cultivos almacenados a -80 °C, estreche E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 y P. aeruginosa PAO1-YdeH cepas en placas de Petri LB-agar utilizando asas de inoculación desechables. Incubar las placas de Petri invertidas durante la noche a 37 °C.
5. Recoger colonias individuales para diferentes cepas de las placas de Petri, inocular cada colonia en 5 mL de medio LB e incubar el cultivo a 37 °C en un agitador orbital de laboratorio a 220 rpm.
6. Cuando la densidad del cultivo alcance OD600nm ~1.0, retire el cultivo del agitador y colóquelo a temperatura ambiente. Ajuste la densidad de cultivo a OD600nm = 1.0, como se describe en el paso 3.2.1.

3. Inoculación e incubación de placas de enjambre de gradiente

1. Preparación de pozos de inoculación
   NOTA: Se pueden utilizar modelos de portada de impresión 3D capaces de generar pozos separados por una distancia estándar en lugar del método que se describe a continuación.
   1. Marque las posiciones de los pocillos en papel A4, como se muestra en la Figura 1C. Establezca tres concentraciones de prueba en una placa de Petri cuadrada con dos o tres réplicas.
   2. Coloque el papel A4 marcado debajo de una placa degradada solidificada. Empuje el lado más ancho de una punta de pipeta de 100 μl en la superficie del medio semisólido en la posición marcada. Presione la punta de la pipeta hasta que llegue a la parte inferior del medio de la capa superior.
   3. Cuando la punta toque el fondo, no aplique fuerza vertical a la punta; Gire suavemente la punta para aislar el contenido del pocillo cilíndrico.
   4. Mueva horizontalmente las puntas de la pipeta a lo largo de una distancia muy pequeña para permitir el flujo de aire hacia el espacio estrecho reservado. Presione la punta con el dedo índice para bloquear el flujo de gas dentro de la punta mientras sujeta la pipeta con el pulgar y el dedo corazón.
   5. Tire de la punta verticalmente, manteniendo el contenido del pozo en la punta mientras la saca.
      NOTA: Si el contenido del pozo se desliza, aplique un poco más de presión con el dedo índice para sellar la punta por completo.
   6. Repita los pasos 3.1.2 a 3.1.5 en cada posición marcada. Cubra la placa del enjambre antes de la inoculación.
2. Inoculación e incubación con placa de gradiente
   1. Ajuste la densidad del cultivo de crecimiento nocturno a OD600nm = 1.0.
   2. Pipetee 80 μL del cultivo de crecimiento nocturno en cada pocillo. No derrame el cultivo bacteriano fuera de los pocillos.
   3. Envuelva las placas con una película de sellado. Para la observación a largo plazo (3-5 días), envuelva las placas con cinta adhesiva estéril de laboratorio.
      NOTA: Es menos probable que la cinta de goma se rompa.
   4. Coloque un vaso de precipitados lleno de ddH₂O en la incubadora para mantener la humedad dentro de la incubadora. Incubar las placas de enjambre de gradiente a 37 °C.
      NOTA: No incube las placas de enjambre al revés; Esto hará que el cultivo bacteriano se filtre de los pocillos.
   5. Tome imágenes de la placa del enjambre inmediatamente después de la inoculación, registrándola como el punto de tiempo de 0 h.

4. Imágenes de enjambre de superficies bacterianas

1. Saque las placas de enjambre, una a la vez, de la incubadora cada 12 h, sosteniendo la placa horizontalmente, y colóquelas en el sistema de imágenes de gel (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: No deje huellas dactilares en la superficie de las placas; Sostenga el costado de la placa de enjambre con guantes limpios.
2. Seleccione el modo de imagen en gel ; exponga la placa del enjambre a la luz blanca; y ajuste la distancia focal para brindar la vista más clara de los enjambres.
   NOTA: Utilice la misma distancia focal para todas las placas de un lote determinado.
3. Mejore el brillo de los enjambres para una observación clara ajustando el tiempo de exposición a 300 ms. Ajuste el umbral para minimizar la interferencia de la luz de fondo.
   NOTA: El umbral se ajusta en la interfaz operativa del sistema de imágenes en gel. Aumente los valores a la izquierda para minimizar la interferencia de la luz de fondo; Disminuya los valores a la derecha para mejorar el brillo de los enjambres. En este protocolo, la región suele estar entre 6.000 y 50.000.
4. Guarde el archivo de imagen para su posterior análisis. Registre el tiempo de imagen, el tipo de inductor, la orientación del gradiente y las deformaciones en un archivo .txt .

 

Tabla 1: Especificaciones del medio de enjambre de doble capa.

Capa superior media/caldo de lisogenia (por 100 mL)
Triptona: 1 g
Cloruro de sodio: 1 g
Extracto de levadura: 0,5 g
Agar: 0,7 g
Medio de capa inferior/medio que contiene inductores (por 100 ml)
Triptona: 1 g	Concentración de trabajo:	Concentración de la solución madre:
Cloruro de sodio: 1 g
Extracto de levadura: 0,5 g	- Resveratrol: 400 μM	- Resveratrol: 100 mM
Agar: 0,7 g
Inductor:	- Arabinose: 0,5% (p/v)	- Arabinosa: 20% (p/v)
- Solución madre de resveratrol: 400 μL	o 1% (p/v)
- Solución madre de arbinosa: 2,5 ml o 5 ml

Resultados

Figura 1: Esquema de preparación, inoculación e incubación de placas de enjambre de gradiente de inductor. (A) Crecimiento nocturno de cultivo bacteriano a 37 °C. (B) Flujo de trabajo de la placa de enjambre de gradiente inductor de doble ca...

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