Detección colorimétrica de la degradación de la corteza durante la germinación de esporas bacterianas

Resumen

Fuente: Francis, M. B., et al. Detección de fragmentos de corteza durante la germinación de esporas bacterianas. J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra un método colorimétrico para detectar la degradación de la corteza durante la germinación de esporas bacterianas midiendo la liberación de azúcares reductores a lo largo del tiempo. Utilizando estándares de N-acetilglucosamina y muestras de puntos de tiempo, el ensayo cuantifica la concentración de azúcar a través de una reacción cromogénica púrpura, lo que indica el grado de hidrólisis de la corteza.

Protocolo

1. Reactivo de color

1. Mientras las muestras están en hielo, prepare el reactivo de color. Disuelva 0,320 g de p-dimetilaminobenzaldehído (DMAB; Reactivo de Ehrlich) en 1,9 ml de ácido acético glacial.
   Nota: El reactivo es sensible al tiempo, la temperatura y la luz y no debe fabricarse con anticipación.
2. Después de que el DMAB se disuelva por completo, agregue 100 μl de HCl 10 N y vórtice.
3. Añadir 5 ml de ácido acético glacial y vórtice.

2. Reacción colorimétrica

1. Transfiera 100 μl de cada muestra de corteza enfriada a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Agregue 700 μl de la solución de color recién preparada a cada muestra.
3. Transfiera inmediatamente las muestras a un baño de agua a 37 °C e incube durante EXACTAMENTE 20 min.
4. Transfiera 200 μl de cada muestra a una placa transparente de 96 pocillos.
5. Cuantifique las muestras a 585 nm en un lector de placas. Las muestras deben comenzar con un color amarillo y una reacción positiva cambiará a púrpura. Cuanto más corteza esté presente, más profundo será el color púrpura.

Materiales