Producción y recuperación de proteínas recombinantes a partir de vesículas derivadas de bacterias

Resumen

Fuente: Streather, B. R., et al. Producción y análisis optimizados de vesículas rellenas de proteínas recombinantes de E. coli. J. Vis. Exp. (2023)

Este video demuestra la producción y el aislamiento de proteínas recombinantes marcadas con péptido nucleante de vesículas (VNp) a partir de vesículas bacterianas. Un inductor desencadena la expresión de proteínas marcadas con VNp, impulsando la formación y encapsulación de vesículas, seguidas de centrifugación y sonicación para una recuperación eficiente de proteínas sin lisis celular

Protocolo

1. Cultivo celular bacteriano e inducción de proteínas

1. Para inducir la expresión de proteínas recombinantes del promotor T7, agregue isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de hasta 20 μg/ml (84 μM). La inducción de la expresión de proteínas recombinantes debe ocurrir en la fase logarítmica tardía (es decir, densidad óptica típica, OD₆₀₀ de 0.8-1.0) para la producción de vesículas. ​
   NOTA: La duración del período de inducción puede diferir entre las proteínas, ya que algunas alcanzan la producción máxima a las 4 h y otras durante la noche (18 h). Hasta la fecha, se ha obtenido la máxima exportación de vesículas en cultivos nocturnos.

2. Aislamiento de vesículas recombinantes

1. Granular las células por centrifugación a 3.000 x g (4 °C) durante 20 min.
2. Para esterilizar los medios que contienen vesículas para su almacenamiento a largo plazo, pase los medios de cultivo autorizados a través de un filtro de polietersulfona (PES) estéril y sin detergente.
   NOTA: Para probar la exclusión de células viables del filtrado que contiene vesículas, coloque en agar caldo de lisogenia (LB) e incube durante la noche a 37 ° C.
3. Para concentrar las vesículas en un volumen más pequeño, pase el medio estéril que contiene vesículas a través de un filtro estéril y sin detergente de 0,1 μm de ésteres de celulosa mixtos (MCE).
4. Lave suavemente la membrana con 0,5-1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) con un raspador de células o un esparcidor de plástico para eliminar cuidadosamente las vesículas de la membrana. Transfiera a un tubo de microfuga nuevo. ​
   NOTA: Las vesículas purificadas se pueden almacenar en medios estériles o PBS a 4 °C. Existen ejemplos de proteínas recombinantes almacenadas en estas vesículas durante 6 meses, de esta manera, sin pérdida de actividad enzimática.

3. Liberación de proteínas solubles de vesículas aisladas

1. Una vez aisladas las vesículas que contienen proteínas en el medio/tampón estéril, someter las membranas lipídicas vesiculares a sonicación utilizando un programa adecuado para el aparato (por ejemplo, 6 ciclos de encendido y apagado de 20 s) y centrifugar a 39.000 x g (4 °C) durante 20 min para eliminar los restos de vesículas. NOTA: El choque osmótico o el tratamiento detergente se pueden usar como una alternativa para abrir las vesículas, pero se debe considerar el impacto sobre la funcionalidad de la proteína y / o la aplicación posterior.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)	Melford	367-93-1
Caldo de lisogenia (LB) / agar LB	Stock de laboratorio	NA	10 g/L de triptona; 10 g/L de NaCl; 5 g/L de extracto de levadura (1,5 g/L de agar)
MF-Millipore Filtro de membrana (0,1 μm, MCE)	Merck	VCWP04700
Filtro de membrana Millipore Express PLUS (0,45 μm, PES)	Merck	HPWP04700
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Stock de laboratorio	NA