F Transferencia de plásmidos y selección dual de antibióticos en E. coli

Resumen

Fuente: Erdogan, F., et al., Ensayos de apareamiento conjugativo para el análisis específico de secuencias de proteínas de transferencia involucradas en la conjugación bacteriana. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el procedimiento para transferir un plásmido F de células de E. coli del donante al receptor utilizando un plásmido de rescate y seleccionando transconjugantes a través de una doble resistencia a los antibióticos. El proceso incluye la mezcla de cultivos bacterianos, la incubación sin agitación, la interrupción de los pares de apareamiento y la siembra en medios selectivos para confirmar la transferencia exitosa de plásmidos.

Protocolo

1. Ensayo de apareamiento conjugativo de donantes XK1200 a receptores MC4100

1. Preparar un cultivo O/N de células XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gene en 20 ml de caldo de lisogenia estéril (LB) con 20 μg/ml de cloranfenicol (Cm), 50 μg/ml de kanamicina (Km) y células MC4100 en 5 ml de LB con 50 μg/ml de estreptomicina (Sm) utilizando células de un stock de glicerol o de una sola colonia en una placa de agar y una pipeta o asa estéril. Cultiva cultivos a 37 °C con agitación de 200 rpm.
2. Realice diluciones 1:70 de cada cultivo de O/N por separado en 2 ml de LB estéril con los mismos antibióticos. Agregue glucosa a una concentración final de 100 mM a todas las células donantes. Cultivar células hasta la fase logarítmica media (OD₆₀₀ 0,5-0,7) a 37 °C con agitación a 200 rpm.
3. Centrifugar (4.000 x g durante 5 min a 4 °C) para granular las células, desechar el sobrenadante, lavar una vez con LB estéril en frío para eliminar los antibióticos y volver a suspender las células en 2 ml de LB estéril en frío.
4. Por duplicado, alícuotas de 100 μL de cada cultivo en 800 μL de medio LB estéril y déjelos acoplar a 37 °C durante 1 h sin agitar.
5. Agite las células durante 30 s para interrumpir las parejas de apareamiento y colóquelas en hielo durante 10 minutos para evitar que se sigan apareando.
6. Usando la mezcla en vórtice y LB estéril fresco, prepare 6 diluciones (^10-2 a ^10-7) de los transconjugantes. Seleccione para las células transconjugantes MC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm detectando 10 μL de alícuotas de cada dilución en cada mitad de las placas de agar que contienen 50 μg/mL Sm y 20 μg/mL Cm, como en la Figura 1. Repita para ambas mezclas duplicadas. Mantenga el área estéril y trabaje cerca de una llama. Incubar placas O/N a 37 °C.

Resultados

Figura 1: Ensayo de apareamiento para evaluar la función del gen diana en la conjugación. Las células donante y receptora fueron E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm transformadas con pK184-TraF y MC4100, respecti...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de Petri	Fisher Scientific	FB0875713
Antibióticos			Concentraciones Finales
Cloranfenicol (cm)	Fisher Scientific	BP904-100	20 μg/ml
Kanamicina (km)	BioBasic Inc.	DB0286	50 μg/ml
Estreptomicina (Sm)	Fisher Scientific	BP910-50	50 μg/ml