Inactivación de bacterias mediante mononucleótido de flavina activado por luz

Resumen

Fuente: Cheng, C., et al. Inactivación de patógenos mediante fotólisis con luz visible de riboflavina-5′-fosfato. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra un método para evaluar los efectos fototóxicos del mononucleótido de flavina (FMN) en bacterias patógenas. Los cultivos bacterianos se exponen a concentraciones crecientes de FMN y se iluminan con luz visible para generar especies reactivas de oxígeno (ROS) que dañan los componentes celulares. Luego, las bacterias sobrevivientes se cuantifican para evaluar la reducción de la viabilidad dependiente de la dosis.

Protocolo

1. Viabilidad de Staphylococcus aureus (S. aureus) después de la fotólisis FMN (Figura 1)
   1. Transmitir una colonia de S. aureus (BCRC 10451) de una placa cultivada a 10 ml de caldo de lisogenia tomado en un tubo de ensayo con tapa de rosca de 15 ml. Cultivar en una coctelera a 37°C durante 16 h.
   2. Transfiera 0,5 ml del cultivo a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Agregue agua esterilizada en el tubo de centrífuga para diluir el cultivo a una densidad óptica de 0,5 a 600 nm (OD₆₀₀) (~6 x 10⁷ unidad formadora de colonias [UFC]/ml).
   3. Transfiera 0,5 ml del cultivo a un tubo de centrífuga de 1,5 ml, centrifugue a 14.000 x g durante 10 minutos y decante el sobrenadante para obtener un sedimento celular.
   4. Agregue 1 ml de riboflavina-5'-fosfato (o mononucleótido de flavina; FMN) (30, 60 y 120 μM FMN en tampón de fosfato de potasio [PB]) a los gránulos celulares obtenidos como en el paso 1.3 y vórtice. Para el control irradiado, agregue 1 ml de PB solo.
   5. Transfiera 1 ml de cada una de las soluciones celulares bacterianas viables que contengan 30 μM de FMN y PB solos en tubos de vidrio e irradie con luz violeta a 10 W/m² durante 30 min.
   6. Transfiera 1 ml de cada una de las soluciones celulares bacterianas viables que contengan 30, 60 y 120 μM de FMN y PB solas en tubos de vidrio e irradie con luz azul a 20 W/^m2 durante 120 min. Instale otro tubo de vidrio con 1 ml de solución de células bacterianas viables que contenga 120 μM de FMN e irradie con luz azul a 20 W/^m2 durante 60 min.
   7. Configure los tubos de ensayo como se describe en los pasos 1.5 y 1.6 y cúbralos con papel de aluminio grueso. Estos tubos sirven como controles oscuros.
   8. Mantenga la cámara de irradiación (así como los controles oscuros) en una cámara frigorífica a 9 ± 1 °C durante el período de irradiación de 30-120 min.
      NOTA: El calor liberado por las luces de diodos emisores de luz (LED) no se puede ignorar, ya que los chips LED colocados dentro de la copa pueden calentar el sistema de fotorreacción durante los experimentos de irradiación. Por lo tanto, los experimentos se llevaron a cabo en una cámara frigorífica mantenida a 9 ± 1 °C.
   9. Después de la irradiación, transfiera 0,2 ml de cada una de las soluciones de reacción a una placa de agar Luria (LA). Esparcir las bacterias sobre la placa con una varilla de vidrio en forma de L e incubar durante la noche a 37 °C.
   10. Calcule el recuento viable en placa y las tasas de inactivación de S. aureus después del crecimiento nocturno.

NOTA: La tasa de inactivación de S. aureus se calcula como el porcentaje de reducción, que es igual a [1 -I / D] ×100%, donde I y D denotan, respectivamente, el número de UFC en la muestra irradiada y el control oscuro. El porcentaje de reducción se define como un valor negativo de la tasa de inactivación.

Resultados

Figura 1: Efecto de la fotólisis de FMN en la viabilidad de S. aureus . La reducción porcentual se define como un valor negativo de la tasa de inactivación de S. aureus tratada con (A...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Luces LED azules, verdes y rojas	Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwán		CC 12 V 5050
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Termómetro infrarrojo	Condado de Raytek Santa Cruz, CA	MT4
Caldo LB	Difco Co., Nueva Jersey
L-Metionina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canadá
Fuente de alimentación	China tech Co., ciudad de New Taipei, Taiwán	YP30-3-2
Riboflavina 5′-fosfato	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R7774
ARNasa	New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Medidor de energía solar	Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwán	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Centro de Investigación y Recolección de Recursos Biológicos (BCRC), Hsinchu, Taiwán	10451
Espectrómetro óptico UV-Vis	Óptica oceánica, Dunedin, FL	USB4000
Espectrofotómetro UV-Vis	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokio, Japón	U-2900
LED violeta	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China