Cuantificación de la inactivación bacteriana inducida por la luz a través de la generación de especies reactivas de oxígeno

Resumen

Fuente: Cheng, C., et al. Inactivación de patógenos mediante fotólisis con luz visible de riboflavina-5′-fosfato. J. Vis. Exp. (2022).

En este video, una mezcla de reacción tamponada que contiene L-metionina, nitro azul tetrazolio (NBT) y mononucleótido de flavina (FMN) se irradia con luz violeta para inducir la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Esto conduce a la inactivación bacteriana y a la formación de formazán detectable espectrométricamente.

Protocolo

1. Detección de especies reactivas de oxígeno (O₂•⁻) en Staphylococcus aureus

1. Prepare las muestras de Staphylococcus aureus .
2. Diluir la densidad bacteriana de las muestras con agua esterilizada a una densidad óptica de 0,5 a 600 nm (OD (densidad óptica)₆₀₀, ~6 x 10⁶ UFC (unidad formadora de colonias) /mL). Transfiera 0,5 ml del cultivo a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y decantar el sobrenadante para obtener un pellet celular.
3. Agregue 0,1093 g de L-metionina, 0,1 g de NBT (cloruro de tetrazolio azul nitro) y 25 ml de FMN (mononucleótido de flavina) (400, 240 o 120 μM) a 75 ml de PB (tampón de fosfato). Por cada 1 ml del reactivo aplicado, las concentraciones finales de FMN, metionina y NBT son 100 (60 o 30) × ^10-6 M, 7,3 × ^10-3 M y 1,2 × ^10-3 M, respectivamente.
4. Agregue 1 ml de cada solución reactiva (es decir, con concentraciones variables de FMN) a los gránulos celulares obtenidos. Irradiar las soluciones con luz violeta a 10 W/^m2 durante 10 min.
5. Centrifugar la mezcla a 14.000 x g durante 10 min y decantar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para extraer el NBT reducido. Detecte las especies de O₂•⁻ producidas a partir de la absorbancia a 560 nm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Termómetro infrarrojo	Condado de Raytek Santa Cruz, CA	MT4
Caldo LB	Difco Co., Nueva Jersey
L-Metionina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT (cloruro de tetrazolio azul nitro)	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canadá
Fuente de alimentación	China tech Co., ciudad de New Taipei, Taiwán	YP30-3-2
Riboflavina 5′-fosfato	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R7774
Medidor de energía solar	Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwán	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Centro de Investigación y Recolección de Recursos Biológicos (BCRC), Hsinchu, Taiwán	10451
Espectrómetro óptico UV-Vis	Óptica oceánica, Dunedin, FL	USB4000
Espectrofotómetro UV-Vis	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokio, Japón	U-2900
LED violeta	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China