Cuantificación de la inactivación bacteriana inducida por la luz a través de la generación de especies reactivas de oxígeno

Abstract

Fuente: Cheng, C., et al. Inactivación de patógenos mediante fotólisis con luz visible de riboflavina-5′-fosfato. J. Vis. Exp. (2022).

En este video, una mezcla de reacción tamponada que contiene L-metionina, nitro azul tetrazolio (NBT) y mononucleótido de flavina (FMN) se irradia con luz violeta para inducir la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Esto conduce a la inactivación bacteriana y a la formación de formazán detectable espectrométricamente.

Protocol

1. Detección de especies reactivas de oxígeno (O₂•⁻) en Staphylococcus aureus

1. Prepare las muestras de Staphylococcus aureus .
2. Diluir la densidad bacteriana de las muestras con agua esterilizada a una densidad óptica de 0,5 a 600 nm (OD (densidad óptica)₆₀₀, ~6 x 10⁶ UFC (unidad formadora de colonias) /mL). Transfiera 0,5 ml del cultivo a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y decantar el sobrenadante para obtener un pellet celular.
3. Agregue 0,1093 g de L-metionina, 0,1 g de NBT (cloruro de tetrazolio azul nitro) y 25 ml de FMN (mononucleótido de flavina) (400, 240 o 120 μM) a 75 ml de PB (tampón de fosfato). Por cada 1 ml del reactivo aplicado, las concentraciones finales de FMN, metionina y NBT son 100 (60 o 30) × ^10-6 M, 7,3 × ^10-3 M y 1,2 × ^10-3 M, respectivamente.
4. Agregue 1 ml de cada solución reactiva (es decir, con concentraciones variables de FMN) a los gránulos celulares obtenidos. Irradiar las soluciones con luz violeta a 10 W/^m2 durante 10 min.
5. Centrifugar la mezcla a 14.000 x g durante 10 min y decantar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para extraer el NBT reducido. Detecte las especies de O₂•⁻ producidas a partir de la absorbancia a 560 nm.

Materials