Determinación de la eficacia antibacteriana de una tira polimérica cargada de antibióticos

Resumen

Fuente: Sekar, A., et. al., Un método novedoso para determinar la actividad antibacteriana longitudinal de los materiales liberadores de fármacos. J. Vis. Exp. (2023)

Este video demuestra un ensayo basado en luminiscencia para evaluar la eficacia antibacteriana de una tira polimérica cargada de antibióticos mediante la cuantificación de la luminiscencia impulsada por ATP, que disminuye en los cultivos bacterianos expuestos al antibiótico.

Protocolo

Configuración del estudio de actividad antibacteriana dependiente del tiempo

1. Cultive las bacterias durante la noche en 1 ml de caldo TSB (caldo de soja tríptico).
2. Diluya la suspensión bacteriana cultivada durante la noche a 10⁵ UFC/ml en MHB estéril (caldo de Mueller-Hinton) y verifique el recuento bacteriano viable utilizando las unidades de luminiscencia antes de comenzar el experimento.
3. Coloque el UHMWPE virgen (polietileno de peso molecular ultra alto) y las tiras de UHMWPE cargadas con fármaco (3 mm x 5 mm x 10 mm) dentro de una jeringa de 3 ml.
4. Extraiga MHB que contenga 10⁵ UFC/ml en la jeringa a través de la aguja adjunta hasta la marca de 1,5 ml, lo que equivale a 1,35 ml de MHB (Figura 1: Paso 1).
5. Coloque la configuración de la jeringa en una incubadora agitadora (100 rpm) a 37 °C hasta los puntos de tiempo indicados: 6 h, Día 1, Día 2, Día 3, Día 4, Día 5, Día 6 y Día 7 (Figura 1: Paso 2).
6. En cada punto de tiempo indicado, saque la configuración de la jeringa y realice un ensayo de viabilidad microbiana en tiempo real en 100 μL de suspensión bacteriana (Figura 1: Paso 3-4).
   1. Realice el ensayo basado en luminiscencia utilizando placas blancas de 96 pocillos de fondo opaco.
   2. Mezcle 100 μL de suspensiones bacterianas diluidas con 100 μL de reactivo de ensayo.
   3. Coloque una tapa cubierta con papel de aluminio sobre la placa preparada de 96 pocillos e incube durante 5 minutos a 100 rpm agitando.
   4. Mida la luminiscencia inmediatamente con un lector de microplacas utilizando los siguientes ajustes del software Gen5 3.11.
      1. Haga clic en Nuevo para configurar un protocolo en la ventana del Administrador de tareas .
      2. Seleccione Costar 96 blanco opaco en el menú desplegable para Tipo de placa.
      3. Haga clic en Leer en el menú Seleccionar pasos > acciones .
      4. Haga clic en Luminiscencia dentro de la ventana Método de lectura . Mantenga seleccionadas las opciones de fibra de punto final/cinética y luminiscencia en tipo de lectura y tipo de óptica, respectivamente. Haga clic en Aceptar.
      5. Mantenga la configuración en la ventana Paso de lectura (ganancia = 135; tiempo de integración = 1 segundo; altura de lectura = 4,5 mm). Haga clic en Aceptar.
      6. La ventana de disposición de placas aparece lista para la ejecución. Marque la casilla Usar tapa en la ventana de la placa de carga y haga clic en Aceptar.
      7. Coloque la placa de 96 pocillos en la máquina para leer los valores de luminiscencia.
7. Determine el recuento de bacterias viables para los puntos de tiempo de 6 h, Día 1, Día 2, Día 3 y Día 7. Determine las UFC (unidades formadoras de colonias) / ml a partir de las unidades de luminiscencia utilizando la curva estándar correspondiente.
8. Verificar la ausencia de bacterias viables en las muestras que mostraron valores de luminiscencia por debajo del límite de detección realizando el método de placa extendida en placas TSA (agar de soja tríptico) e incubando a 35 °C durante la noche. Verifique la presencia de colonias al día siguiente.
9. Centrifugar la suspensión bacteriana restante a 10.000 × g durante 10 min y aspirar suavemente el medio gastado. Para tubos en los que los gránulos no se observan visualmente debido a la actividad antibacteriana de los medicamentos, deje 100 μL en el tubo para asegurarse de que el gránulo invisible no se altere (Figura 1: Paso 5).
10. Vuelva a suspender las bacterias granuladas en MHB fresco y retire la suspensión bacteriana en la misma configuración de jeringa a través de la aguja adjunta (Figura 1: Paso 6).

Resultados

Figura 1: Una representación esquemática de la configuración experimental.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ATCC 12600	Colección de cultivos tipo americano, VA, EE. UU.
Ensayo de viabilidad celular microbiana BacTiter-Glo	Promega Corporation, Estados Unidos	G8231
BD Bacto Caldo de Soja Tríptico (Medio de Digestión de Soja-Caseína)	Becton-Dickinson, Estados Unidos	BD 211825	Comprado en Fisher Scientific, EE. UU.
Jeringa estéril BD Luer-Lok, de un solo uso, 3 ml	BD, Estados Unidos	309657
Aguja BD 5/8 in. de un solo uso, estéril, 25 G	BD, Estados Unidos	305122
Medios de cultivo deshidratados BD BBL: Caldo Mueller Hinton II (ajustado por catión)	Becton-Dickinson, Estados Unidos	B12322	Comprado en Fisher Scientific, EE. UU.
Medios de cultivo deshidratados BD Difco: agar de soja tríptico (agar digerido de soja y caseína)	Becton-Dickinson, Estados Unidos	DF0369-17-6	Comprado en Fisher Scientific, EE. UU.
Sulfato de Gentamicina	Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China
Incubadora de agitación de sobremesa LSE	Corning, Nueva York, Estados Unidos
Lector de placas (Synergy H1	Biotek, VT, EE. UU.
Agitador Innova 2100	New Brunswick Scientific, Nueva Jersey, Estados Unidos
UHMWPE	GUR1020, Celanese, TX, Estados Unidos
Clorhidrato de vancomicina	Fagron, Países Bajos	804148