Patrones microfluídicos y seguimiento basado en fluorescencia del crecimiento bacteriano unicelular

Resumen

Fuente: Pioli, R., et al., Patrón de microorganismos y micropartículas a través del ensamblaje secuencial asistido por capilaridad. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra el método de capturar células individuales de Escherichia coli (E. coli) marcadas con fluorescencia en trampas microfluídicas utilizando una suspensión libre de carbono y un flujo controlado, seguido de la adición de nutrientes para desencadenar el crecimiento y las imágenes de fluorescencia de las microcolonias.

Protocolo

1. Patrones bacterianos

1. Un día antes del experimento, cultive una población de Escherichia coli (cepa MG1655 prpsM-GFP). Inocular el cultivo directamente del caldo congelado y cultivar durante la noche durante 20 h en medio de caldo de lisogenia (LB) en una incubadora agitadora a 37 °C. Añadir 50 μg/mL de kanamicina para que las células retengan el plásmido prpsM-GFP (proteína verde fluorescente).
2. El día del experimento, configure la incubadora de caja (Figura 1A) a 37 ° C varias horas antes del experimento para garantizar una temperatura uniforme y estable antes de comenzar. Luego, coloque la bomba de jeringa y la placa de vidrio calentada en la platina del microscopio (Figura 1B, C), ajustando la temperatura a la misma temperatura que la incubadora de caja.
   NOTA: La incubadora de caja en la que se encierra todo el sistema, incluido el microscopio (Figura 1E), garantiza que se mantenga una temperatura uniforme y constante durante todo el experimento cuando el canal se enjuaga con medio.
3. Noventa minutos antes del experimento, coloque el chip microfluídico en un recipiente lleno de etanol al 100% (EtOH) y enjuague el canal con EtOH al 100% durante al menos 10 min. Coloque el chip microfluídico en un desecador de vacío y desgasifique durante al menos 30 min. Cambie el EtOH por agua destilada y trate al vacío el chip durante al menos 30 min. Introducir el chip microfluídico en el horno a 70 °C durante 10 min para eliminar cualquier rastro de líquido que quede en el canal.
   NOTA: Este paso es necesario para evitar la formación de burbujas en el canal cuando se enjuaga con medio de cultivo.
4. Pipetear 1 ml de medio de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) (1x) en un vial de centrífuga y añadir 10 μl de fosfato potásico 0,132 M (K₂HPO₄). Sacar el cultivo nocturno de la incubadora a 37 °C y alícuota 100 μL en el vial de centrífuga y centrifugar el cultivo a 2.300 × g durante 2 min. Pipetee suavemente el sobrenadante de los viales de la centrífuga y vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de medio MOPS fresco con 0,015 % v/v de Tween 20 y 0,01 % v/v de fosfato de potasio.
   NOTA: La concentración típica de la suspensión bacteriana está en el rango de 0,015-0,15% en volumen, lo que asegura la formación de una zona de acumulación extendida y móvil y evita la acumulación de partículas en el sustrato. Reemplazar el medio nocturno con medio fresco minimiza el riesgo de liberar películas de bacterias en la plantilla. La falta de una fuente de carbono en el medio fresco impide que las células crezcan en la suspensión durante el patrón de plantilla. Es necesaria una concentración del 0,015% v/v de Tween 20 en la suspensión para que el ángulo de contacto del líquido que retrocede en la plantilla del PDMS se encuentre dentro del rango óptimo, entre 30 y 60°.
5. Cargue la suspensión bacteriana en una jeringa de 1 ml y conecte la jeringa al chip a través de un tubo microfluídico.
   1. Para asegurar la conexión entre la jeringa y el tubo, inserte directamente una aguja con un diámetro exterior de 0,6 mm en el tubo. Para evitar dispersar cualquier suspensión que quede en las proximidades de la entrada a través del canal, enjuague el medio nuevo a través del orificio utilizado como salida durante el proceso de modelado (Figura 2A-III), en lugar del orificio utilizado como entrada.
   2. Monte la jeringa en la bomba de jeringa e inyecte la suspensión en el chip microfluídico a través de la entrada ubicada en la parte aguas arriba del canal hasta que la suspensión cubra la región de la plantilla con trampas. NOTA: Durante el proceso de inyección de líquido, el aire puede escapar a través de una salida ubicada en el extremo aguas abajo del canal.
   3. Configure la bomba de jeringa para extraer la suspensión bacteriana (Figura 2A-I) a un caudal de 0,07-0,2 μL/min, que en la geometría descrita corresponde a una velocidad de retroceso del menisco de 80-100 μm/min.
   4. Supervise el proceso de modelado a través del software del microscopio.
      NOTA: Aquí, se utilizó un aumento de 10x para monitorear el retroceso del menisco en la plantilla, y se usó un aumento de 20x para monitorear la deposición de bacterias individuales en las trampas microfabricadas.
6. Una vez que la plantilla se ha modelado con células (Figura 2A-II), aumente el caudal de extracción para vaciar rápidamente el canal microfluídico y enjuagarlo con LB nuevo que se desgasificó previamente durante al menos 30 min y se precalentó a 30 °C.
7. Ajuste la bomba de jeringa a un caudal de 2 μl/min para enjuagar suavemente el canal. Una vez que se haya llenado el canal, aumente el caudal (15 μL / min) de acuerdo con las necesidades experimentales específicas.
8. Adquiera imágenes de bacterias en crecimiento con el aumento y el intervalo de tiempo deseados.

Resultados

Figura 1: Esquema de la plataforma para el ensamblaje secuencial asistido por capilaridad en un canal microfluídico. (A) Incubadora de cajas. La incubadora de cajas mantiene una temperatura uniforme y constante (aquí, 30 °C) dentro del canal...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa BD de 10 ml (Luer-Lock)	BD	300912	Se utiliza para enjuagar el caldo fresco de lisogenia en el canal microfluídico
Incubadora de cajas	Servicios de imágenes de vida		Se utiliza para garantizar una temperatura uniforme y constante en el canal
Centrífuga	Eppendorf	5424R	Se utiliza para reemplazar los medios nocturnos con medios mínimos nuevos
Vial de centrífuga	Eppendorf	30120086	1,5 ml
CETONI Base 120	CETONI GmbH		Bomba de jeringa
CONTROLADOR H401-T	Okolab		Controlador de la placa de vidrio calentada
H601-NIKON-TS2R-VIDRIO	Okolab		Placa de vidrio calefactada
Jeringas de insulina, U 100, con luer	Codan Medical ApS	CODA621640	Jeringa de 1 ml utilizada para extraer la suspensión líquida durante el proceso de estampado
LB Caldo, Molinero (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	244610	Caldo de lisogenia lavado en el canal microfluídico
Tubería de transferencia Masterflex	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x)	Teknova	M2101	Diluido diez veces con agua miliQ y utilizado para reemplazar el medio nocturno
Nikon Eclipse Ti2	Instrumentos Nikon		Microscopio
Fosfato de potasio dibásico	Sigma Aldrich	P3786	Añadido a MOPS 1x
Interpolación 20	Sigma Aldrich	P1379	Se utiliza para garantizar un ángulo de contacto de retroceso óptimo durante el proceso de estampado