Ensayo de biosensor bacteriano para detectar mercurio biodisponible en condiciones anaeróbicas

Resumen

Fuente: Stenzler, B. R. et. al., Un ensayo biosensor anaeróbico para la detección de mercurio y cadmio. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra el uso de biosensores bacterianos modificados genéticamente para medir con precisión la fracción biodisponible de iones de mercurio en condiciones anaeróbicas. Al variar la concentración de sulfato de magnesio, el ensayo garantiza que el biosensor responda selectivamente a los iones de mercurio libres, como lo indican los cambios en la intensidad de la fluorescencia.

Protocolo

1. Ensayo de exposición

1. Diseño de un diseño de placa.
   NOTA: Asegúrese de tener todos los valores de pipeteo calculados y las existencias preparadas antes de comenzar el ensayo de exposición. En el texto se detalla cómo diseñar correctamente un experimento y qué controles incluir. Además, el experimento no debe iniciarse si hay oxígeno en la cámara anaeróbica indicada en el monitor anaeróbico.
2. Diseñe el diseño de la placa de acuerdo con una plantilla de 96 pocillos. Esto permitirá que 32 tratamientos diferentes realicen experimentos en réplicas técnicas de 3, que se representa mejor mediante una cuadrícula de 4 x 8 para configurar viales (ver Figura 1).

NOTA: Cuando se prueba el papel de una variable en la absorción de Hg con el biosensor inducible por mercurio, se requieren dos tratamientos para cada variable: el tratamiento (biosensor + mercurio (Hg) + variable + nitrato) y su tratamiento en blanco (biosensor + variable + nitrato). Al probar el papel de una variable en la fisiología de la célula utilizando el biosensor constitutivo, se requieren dos tratamientos para cada variable: el tratamiento (biosensor + Hg + variable + nitrato) y el tratamiento en blanco (biosensor + variable + Hg). El mercurio puede ser reemplazado por cadmio (Cd). Hg o Cd se convertirán en la variable al realizar una curva de calibración. No es necesario que los biosensores constitutivos e inducibles funcionen al mismo tiempo (en el mismo diseño de placas). En la Tabla 1 se proporciona un ejemplo de plantilla para el diseño de la placa y la cuadrícula correspondiente de 4 x 8 al probar un rango de concentración de magnesio (variable).

2. Configure la cuadrícula de 4 x 8 de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo.

1. Coloque viales estándar de politetrafluoroetileno (PTFE) de 7 ml en la bandeja.
NOTA: Los viales de PTFE deben lavarse con ácido o esterilizarse con calor antes de su uso. Solo deben manipularse manipulando el exterior del vial.

2. A cada vial, añadir el volumen del medio de exposición correspondiente a cada tratamiento.
NOTA: En una exposición con un volumen total de 2.000 μL (2 mL), el medio de exposición añadido será: medio de exposición μL = 2.000 μL – tratamiento (en blanco) μL. (p. ej., medio de exposición μL = 2.000 – 100 μL (biosensor) – 40 μL (nitrato) – 100 μL (Hg) – 100 μL (variable (p. ej., sulfato de magnesio, MgSO₄)) = 1660 μL). Asegúrese de que el volumen agregado de la variable analizada no exceda el 5% (100 μL) del volumen final.

3. Agregue el volumen correspondiente de la solución de la variable química a probar a cada vial, de acuerdo con el diseño de la placa.

4. Agregue nitrato a cada vial para que la concentración final sea de 200 μM (40-80 μL). Excluya este paso para los espacios en blanco de tratamiento con biosensores constitutivos.

5. Agregue Hg (5 nM cuando pruebe una variable) o Cd (300 nM cuando pruebe una variable) a los viales de acuerdo con el diseño de la placa. Excluir este paso para los espacios en blanco de tratamiento con biosensores inducibles por mercurio.

1. Cuando use Hg, tome el caldo de 4-8 μM y agite bien. Diluya la solución en medio de exposición en un vial de PTFE de 7 ml a 100-250 nM para obtener una solución de Hg que funcione. A partir de esta solución de trabajo, agregue Hg a los viales requeridos. En este caso, una curva de calibración de Hg que va de 0 a 12,5 nM.
NOTA: Al probar el efecto de una variable sobre la biodisponibilidad de Hg o Cd, asegúrese de que el [Hg] o [Cd] permanezca constante en todos los tratamientos. Al añadir Hg o Cd, asegúrese de utilizar una punta de pipeta, pero nunca toque el medio de exposición de los viales.

Agite con un movimiento orbital manualmente.
NOTA: El experimento puede detenerse ahora dependiendo del tiempo requerido para que el Hg o el Cd se especien en la solución. Si se deja durante más de una hora, coloque tapas de PTFE en los viales de PTFE para evitar la evaporación / contaminación.

Pipetea suavemente Biosensor Stock hacia adelante y hacia atrás para garantizar la homogeneidad. Agregue 100 μL de Biosensor Stock a cada vial. Agite orbitalmente manualmente.

Prepare el lector de placas para que se caliente para leer con los siguientes criterios: temperatura a 37 ° C, funcionamiento cinético durante 10 horas con lecturas cada 2,5-5 minutos con agitación orbital entre lecturas y mediciones de fluorescencia con una excitación de fluorescencia de 440 nm y una emisión de 500 nm.

Pipetee 200 μL de cada vial de PTFE en la rejilla de 4 x 8 en los pocillos correspondientes de la placa de 96 pocillos (microplacas de superficie negras de fondo transparente de 96 pocillos). Pipetee hacia adelante y hacia atrás cinco veces antes de transferir cada 200 μl.NOTA: En lugar de desechar la punta de la pipeta, deje la punta de la pipeta en el vial de PTFE para realizar un seguimiento del progreso del pipeteo.

Coloque la placa de 96 pocillos en la bandeja del lector de placas, luego coloque la tapa en la placa de 96 pocillos y comience el ensayo.

 

Tabla 1: Un ejemplo de diseño de placa para usar el biosensor para probar la biodisponibilidad de Hg (5 nM) en un gradiente de magnesio (0-10 mM)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

un

Biosensor inducido por Hg + Hg + Nitrato + 0 mM Mg

Biosensor inducido por Hg + Nitrato + 0 mM Mg

Biosensor constitutivo + Hg + Nitrato + 0 mM Mg

Biosensor constitutivo + Hg + 0 mM Mg

b

Biosensor inducido por Hg + Hg + Nitrato + 0,1 mM Mg

Biosensor inducido por Hg + Nitrato + 0,1 mM Mg

Biosensor constitutivo + Hg + Nitrato + 0,1 mM Mg

Biosensor constitutivo + Hg + 0,1 mM Mg

c

Biosensor inducido por Hg + Hg + Nitrato + 1 mM Mg

Biosensor inducido por Hg + Nitrato + 1 mM Mg

Biosensor constitutivo + Hg + Nitrato + 1 mM Mg

Biosensor constitutivo + Hg + 1 mM Mg

d

Biosensor inducido por Hg + Hg + Nitrato + 10 mM Mg

Biosensor inducido por Hg + Nitrato + 10 mM Mg

Biosensor constitutivo + Hg + Nitrato + 10 mM Mg

Biosensor constitutivo + Hg + 10 mM Mg

Materiales