Detección de inhibidores de la pirofosfatasa unida a la membrana bacteriana mediante un ensayo colorimétrico

Resumen

Fuente: Vidilaseris, K., et al. Detección de inhibidores de la pirofosfatasa unidos a la membrana de Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra un ensayo colorimétrico para detectar inhibidores de la pirofosfatasa bacteriana unida a la membrana (mPPasa) mediante la cuantificación de la liberación de ortofosfato. El método permite la identificación de compuestos que inhiben la mPPasa de Thermotoga maritima, un posible objetivo farmacológico antimicrobiano.

Protocolo

1. Reactivos para la preparación del ensayo

1. Prepare la solución de citrato de arsenito.
   1. Pesar 5 g de arsenito de sodio y 5 g de citrato trisódico dihidratado.
      CAUTELA: El arsenito de sodio es tóxico; Por lo tanto, use el equipo de protección adecuado y manéjelo con especial cuidado. Como precaución, no manipule antes de que se hayan leído y entendido todas las precauciones de seguridad necesarias. Manipular solo en una campana extractora para no inhalar polvo/vapores del compuesto o su(s) solución(es). Si se inhala, muévase al aire libre y obtenga atención médica. Use gafas de seguridad química, guantes protectores y ropa adecuados para evitar la ingestión y el contacto con los ojos y la piel. Si se ingiere, llame inmediatamente a un centro de intoxicaciones o a un médico. Si entra en contacto con la piel o los ojos, lávese con abundante agua y busque atención médica.
   2. Disolver en 100 ml de agua.
   3. Agregue 5 ml de ácido acético glacial, mezcle y agregue agua a 250 ml.
   4. Almacenar a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      NOTA: La solución es estable durante más de un año.
2. Prepare la solución A y la solución B.
   1. Para la solución A, agregue 10 ml de HCl 0,5 M helado (ácido clorhídrico) a 0,3 g de ácido ascórbico. Disuelva el ácido ascórbico por vórtice.
   2. Para la solución B, agregue 1 ml de agua helada a 70 mg de heptamolibdato de amonio tetrahidratado y vórtice para disolver.
      NOTA: Guarde ambas soluciones en hielo hasta su uso. Para la consistencia del resultado del ensayo, ambas soluciones se pueden almacenar en hielo durante un máximo de una semana.
3. Prepare el estándar de fosfato (Pi) con la concentración de 0 μM, 62,5 μM, 250 μM y 500 μM para la calibración.
   1. Agregue 0 μL, 25 μL, 50 μL y 100 μL de 5 mM Na₂HPO₄ (fosfato disódico) dihidratado a cuatro microtubos que contengan 370 μL de la mezcla de reacción.
   2. Rellene hasta 1 ml con agua.

2. Ensayo de actividad para una placa de 96 pocillos

NOTA: Consulte la Figura 1 para ver el flujo de trabajo esquemático del ensayo.

1. Agregue 1 ml de solución B a 10 ml de solución A, mezcle por vórtice y almacene la solución en hielo.
   NOTA: Esta solución debe ser transparente y amarilla. Mantenga la solución A + B en hielo durante al menos 30 minutos antes de su uso. Sin embargo, use la solución dentro de las 3 h, ya que se echará a perder después de un almacenamiento prolongado.
2. Agregue 40 μL de estándar Pi de 0 μM, 62,5 μM, 250 μM y 500 μM a las tiras de tubos por triplicado utilizando una pipeta multicanal.
   NOTA: La mezcla de reacción sin Pi agregada se utilizará como un espacio en blanco.
3. Agregue 25 μl de solución compuesta a las tiras de tubos con una pipeta multicanal.
   NOTA: Cada compuesto tiene tres concentraciones diferentes por triplicado, lo que es suficiente para la estimación inicial de la mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC50). Para una determinación más precisa de IC50, se pueden utilizar ocho concentraciones de compuestos diferentes. Para la enzima no inhibida, la solución compuesta se reemplaza con la misma cantidad de agua. Como controles positivos se utilizaron 2,5 μM, 25 μM y 250 μM de sal sódica de imidodifosfato (IDP).
4. Agregue 15 μL de mezcla de solución de mPPasa (pirofosfatasa unida a la membrana) a las tiras de tubos (excepto los tubos que contienen estándar Pi) usando una pipeta multicanal.
5. Selle las tiras de tubos con una lámina de sellado adhesiva. Corta la lámina de sellado para separar cada tira de tubo.
6. Preincubar las muestras durante 5 min a 71 °C. Colocar las muestras en el bloque calefactor con un intervalo de 20 s entre cada tira para minimizar el consumo de tiempo durante los pasos posteriores.
7. Para cada tira, abra el sellado adhesivo. Añadir 10 μl de pirofosfato sódico dibásico 2 mM con una pipeta multicanal y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante 5×. Vuelva a sellar la tira de tubo con el mismo sellado.
   NOTA: Este paso puede ser inicialmente difícil de lograr en 20 s; sin embargo, será más fácil después de algunos ensayos.
8. Incubar a 71 °C durante 5 min.
9. Coloque las muestras en el aparato de enfriamiento con un intervalo de 20 s entre cada tira. Déjelos enfriar durante 10 minutos, pero centrifugue cada tira brevemente después de 5 minutos de enfriamiento, para decantar gotas de agua debajo de la lámina de sellado, luego vuelva a colocarla en el aparato de enfriamiento y retire el sellado.
   NOTA: El aparato de enfriamiento se puede fabricar simplemente colocando una placa de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de 96 pocillos en una placa de Petri de poliestireno (tamaño 150 mm × 15 mm) llena de agua y congelada durante al menos 1 h. El aparato debe sacarse del congelador unos 5 minutos antes del comienzo del ensayo. No saque el aparato de enfriamiento justo antes del enfriamiento de la muestra, ya que congelará la mezcla de reacción y dificultará el desarrollo del color.
10. Después de 10 min de enfriamiento, agregue 60 μL de solución A + B, mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante 5× y mantenga las tiras de tubos en el aparato de enfriamiento durante 10 min.
11. Agregue 90 μL de la solución de arsenito-citrato y manténgala a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para producir un color azul estable.
    CAUTELA: Debido a su toxicidad, todas las soluciones que contienen arsenito de sodio deben manipularse con especial cuidado en todo momento. Por lo tanto, la adición de solución de citrato de arsenito debe realizarse en una campana extractora.
12. Dispense 180 μL de cada mezcla de reacción en una microplaca de poliestireno transparente de 96 pocillos.
13. Mida la absorbancia de cada pocillo a 860 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas.

Resultados

Figura 1: Un flujo de trabajo esquemático del ensayo de inhibición de TmPPasa en un formato de placa de 96 pocillos. La numeración roja muestra los pasos del ensayo según el protocolo, y las flechas azules muestran el orden de los intervalos...

Materiales