Visualización de proteínas de germinación en la membrana interna de esporas bacterianas

Resumen

Fuente: Wen, J., Pasman, et. al., Visualización de germinosomas y la membrana interna en esporas de Bacillus subtilis . (2019)

Este video demuestra el uso de microscopía de iluminación estructurada para adquirir imágenes de fluorescencia tridimensionales que revelan la organización de las proteínas de germinación dentro de la espora bacteriana.

Protocolo

1. Imágenes de proteínas de germinación (tiempo: 1 h)
   1. Capture las imágenes de transmisión y fluorescencia de esporas, así como una mezcla de microesferas fluorescentes modificadas con carboxilato rojo y amarillo-verde en un microscopio de iluminación estructurada (ver tabla de materiales) equipado con un objetivo de aceite de 100x (apertura numérica = 1.49), una cámara CCD (dispositivo de carga acoplada) y software de análisis de imágenes (ver tabla de materiales). Genere todas las imágenes a temperatura ambiente sin la perturbación de la luz ambiental. Asegúrese de limpiar siempre el objetivo 100x y el portaobjetos con etanol al 75% antes de la imagen.
   2. Concéntrese en microesferas fluorescentes de 100 nm (diámetro) y optimice la función de dispersión puntual (psf) ajustando el anillo de corrección en el objetivo de 100x hasta obtener una psf simétrica, minimizando así el desenfoque de la imagen. La psf es la respuesta al impulso o la respuesta de un sistema de imágenes a una fuente puntual o un objeto puntual.
   3. Seleccione un campo de visión con aproximadamente 10 microesferas fluorescentes redondas. Aplique un ajuste de enfoque de rejilla para longitudes de onda de excitación de 561 nm y 488 nm como guía para el software de análisis de imágenes.
   4. Enfoque las esporas con la luz de transmisión y capture una imagen de luz de transmisión en el modo promedio de 16× con exposiciones de 200 ms para cada imagen.
   5. Capture imágenes fluorescentes en bruto 3D-SIM de las esporas con el modo de iluminación "3D-SIM", la configuración de la cámara en el modo de lectura Multiplicación de electrones (EM) Ganancia 10MHz a 14 bits y ganancia EM a 175. Excite la sonda FM4-64 en esporas PS4150 con luz láser de 561 nm al 20% de potencia láser y un tiempo de iluminación de 400 ms.
   6. Excite el GerKB-mCherry y el GerD-GFP en esporas de KGB80 con, respectivamente, luz láser de 561 nm al 30% de potencia láser durante 1 s y luz láser de 488 nm al 60% de potencia láser durante 3 s. La configuración de Z-Stack está en el modo de arriba a abajo, 0,2 μm / paso.
      NOTA: Estos parámetros láser se aplicaron para asegurar un valor de brillo máximo de alrededor de 4.000 para la ventana del histograma.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Portaobjetos de vidrio secados al aire	Menzel Gläser	630-2870
APO TIRF N20R8 100× objetivo de petróleo (NA=1,49)
Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
Bacillus subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Microesferas modificadas con carboxilato FluoSpheres	Invitrogen, 0,1 μm	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	Referencia F34653
Medio de gradiente de densidad no iónico Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158
Imagen J
Cámara CCD iXON3 DU-897 X-6515	Tecnología Andor		https://imagej.net/Welcome
Software de imágenes de microscopio	Nikon, Japón	Elemento NIS AR 4.51.01
MilliQ Agua Ultrapura Desminerizada	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Microscopio Nikon Eclipse Ti
Cubreobjetos de precisión	Paul Marienfeld	117650
Tubos con tapón de rosca 50 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM